Kỹ thuật điện di ADN

Kỹ thuật điện di ADN DNA electrophoresis Khái niệm DNA electrophoresis là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử DNA nhờ một chất nền cố định (gel) trong một điện trường. ADN tich điện âm vì gốc phosphat hình thành khung đường-phosphate của phân tử AND tích điện âm. Trong điện trường di chuyển về cực dương Điện di ADN Điện di ADN Bản gel hoạt động như một giá thể để phân tách các đoạn ADN. ADN th­êng ®­îc ®iÖn di trªn hai lo¹i gel: agarose vµ acrylamid Các lỗ được tạo ra trong bản gel. Chúng được xem như là các giêngs để chứa dung dịch AND Agarose và Polyacrylamide Agarose: có khả năng phân tách các phân tử AND có kích thước lớn khác nhau từ hàng chục thậm chí hàng trăm Kilobase. Không độc Polyacrylamide: Có độ phân giả cao hơn song chỉ phân tách được các đoạn AND có kích thước sai khác ít. Rất độc Điện di ADN Dung dịch AND chứa hỗn hợp các đoạn AND có kích thước khác nhau được đổ vào các giêngs trong bản gel. Điện di ADN Chất nền gel hoạt động như một tấm sàng (sieve). Các phân tử AND lớn đi qua các lỗ trong bản gel khó khăn hơn các phân tử AND nhỏ. Vì vậy, các đoạn phân tử lớn hơn sẽ bị chậm lại so với các phân tử nhỏ khi AND di chuyển trong bản gel. Điện di ADN Quá trình phân tách cứ tiếp tục tạo ra sự phân tách giữa các đoạn AND càng rõ hơn. Điện di ADN Thang phân tử chuẩn thương được đienj di cùng với AND. Thang chuẩn thường là hỗn hợp các đoạn AND đã biết trước kich thước. Được dùng để ước lượng kích thước của các đoạn AND trong mẫu nghiên cứu. Fig 20-1: DNA separation by gel electrophoresis Một số bước chính trong kỹ thuật điện di HiÖn hinh c¸c băng ADN trªn bản gel ®iÖn di Ph­¬ng ph¸p nhuém Ethydium bromid, thuèc thö nµy t¹o c¸c liªn kÕt nhuém víi c¸c baz¬ nit¬. Khi chiÕu ¸nh s¸ng tö ngo¹i (cùc tÝm) vµo bản gel c¸c liªn kÕt nhuém sÏ hÊp phô c¸c b­íc sãng 300 – 360nm vµ ph¸t huúnh quang ë b­íc sãng 590 nm (mµu da cam), kÕt quả cã thÓ ghi nhËn b»ng m¾t th­êng vµ chôp ảnh ®­îc. Ph­¬ng ph¸p nhuém b¹c. Bản gel sau ®iÖn di ®­îc ng©m vµo dung dÞch AgNO3, ADN sÏ t­¬ng t¸c víi AgNO3, khi bæ sung formaldehyt ë pH kiÒm, ion b¹c chuyÓn thµnh b¹c nguyªn tö t¹o c¸c h¹t b¹c kÕt tô cã mµu x¸m, cã thÓ ph¸t hiÖn dÔ dµng. Kết quả điện di AND trên gel This photograph is of various types of DNA that have been electrophoresed on the same gel. Note that high molecular weight DNAs do not separate well on this gel. This can be corrected by altering gel density.   Kết quả điện di AND trên gel có nông đô khác nhau Faster migration in a less concentrated gel Tương quan giữa NĐ agarose và độ lớn của ADN C¸c ®o¹n DNA được cắt bằng RE cã thÓ t¸ch khái nhau t­¬ng øng víi kÝch th­íc cña chóng khi ch¹y ®iÖn di trªn gel agarose. Sau khi ®iÖn di c¸c gel ®­îc nhuém ethidium bromide vµ cã thÓ quan s¸t trùc tiÕp c¸c ®o¹n c¾t d­íi ¸nh s¸ng tö ngo¹i hoÆc chôp ảnh. .vntime Kỹ thuật lai phân tử Cơ sở khoa học Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity) 1) DNA-DNA. 2) DNA-RNA. 3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên-kháng thể ) Các dạng phức hợp lai bổ sung Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc làm lạnh Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính. Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới. Tính đặc hiệu của phản ứng lai 1) lai đặc hiệu: probe gắn với DNA mục tiêu chỉ khi có trình tự bổ sung 2) Lai không đặc hiệu: phản ứng lai xảy ra khi DNA mục tiêu có trình tự tương tự (không bổ sung hoàn toàn) Sự tương hợp giữa mẫu dò và DNA trên thực tế không nhất thiết phải hoàn toàn chính xác. Các trình tự mẫu dò ở những độ sai khác nhất định vẫn có thể bám vào DNA cho dù sự tương hợp không cao. Lẽ dĩ nhiên, độ tương hợp càng thấp thì càng có ít mối liên kết hydro giữa mẫu dò và DNA mạch đơn. Người ta có thể tính toán được khả năng các mẫu dò có độ tương hợp thấp bám vào DNA bằng cách thay đổi nhiệt độ của phản ứng lai hay thay đổi lượng muối trong dung dịch đệm. Phản ứng lai có thể không đặc hiệu Một số trường hợp xảy ra khi lai ADN 42 C is more stringent condition that 35 C (hybridization is more specific) Lai Southern Lµ kü thuËt dïng ®Ó nhËn d¹ng mét ®o¹n DNA ®Æc thï dùa trªn trình tù thÓ hiÖn cña nã sau khi ®iÖn di trªn gel agarose. Ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc ph¸t triÓn bëi Edwin Southern (1975) nªn ®­îc gäi lµ ph­¬ng ph¸p “Southern Blot”. Kỹ thuật Southern Blot cho biết Sự có mặt của đoạn ADN (gen) Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen) Độ lớn của đoạn ADN Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò . Edwin Southern University of Oxford Nguyên tắc Southern Blot dùa trªn khả năng giữ l¹i c¸c ®o¹n ADN ®· qua xö lý enzyme giíi h¹n, trªn mét mµng máng ®Æc biÖt (Hybond - N). Mµng máng nµy sau ®ã ®­îc ng©m trong dung dÞch chøa mẫu dò ®· cho ë d¹ng cã ®¸nh dÊu 32P. NÕu cã mÆt gen ®· cho trong ADN trªn mµng máng thì c¸c ®o¹n ADN cña cïng gen sÏ b¾t cÆp (lai) theo c¬ chÕ bæ sung (complementation) vµ nhËn biÕt qua phãng x¹ tù ghi. C¸c b­íc tiến hành 1. ChuÈn bÞ mÉu: ChiÕt t¸ch ADN nghiªn cøu, c¾t ADN nghiªn cøu b»ng enzym giíi h¹n, kÕt quả cho mét hçn hîp c¸c ®o¹n c¾t cã kÝch th­íc kh¸c nhau. TiÕn hµnh ®iÖn di hçn hîp sản phÈm c¾t trªn gel ®Ó t¸ch c¸c ®o¹n DNA Lµm biÕn tÝnh (t¹o thµnh c¸c sîi ®¬n) c¸c băng ADN trªn gel ®iÖn di b»ng c¸ch xö lý gel với nhiệt độ cao hoặc ®iÖn di 20 phót trong dung dÞch NaOH 0,5M hoÆc NaCl1,5 M C¸c b­íc tiến hành (tiếp) 2. ThÊm truyÒn (blotting): ĐÆt gel lªn hÖ thèng gi¸ chuyÓn (m¸y Blotting) ®Ó chuyÓn nguyªn vÑn c¸c ADN ®· biÕn tÝnh trªn gel lªn mµng lai (mµng nitrocellulose, mµng nylon (giữ chÆt c¸c ®o¹n ADN ®­îc chuyÓn lªn tõ gel ®iÖn di). PhÝa trªn ®Ó mét líp giÊy thÊm. Trªn cïng ®Æt mét vËt nÆng Qu¸ trình thÊm truyÒn thùc hiÖn víi dung dÞch dÉn chuyÓn lµ NaOH 0,5M trong 8-12h. C¸c b­íc tiến hành (tiếp) 3. Lai ph©n tö C¸c ®o¹n ADN cè ®Þnh trªn mµng lai ®­îc ®em lai víi dung dÞch mÉu dß ®· ®­îc ®¸nh dÊu hoÆc b»ng p32 hoÆc mét chÊt g©y phản øng mµu. Qu¸ trình ®­îc thùc hiÖn ë buång lai (nhiÖt ®é 65- 680 C) trong thêi gian 3- 12 giê. Röa mµng lai ë 650 C b»ng dung dÞch SSC (NaCl 3M, natri citrat 0,3 M vµ n­íc, pH=7.0) ®Ó lo¹i bá c¸c mÉu dß kh«ng tham gia phản øng lai. C¸c b­íc tiến hành (tiếp) 4. X¸c ®Þnh kÕt qña b»ng kü thuËt phãng x¹ tù ghi (autoradiogragh). Mµng lai sau khi ®­îc lµm kh«, lÊy mét tÊm phim nh¹y X quang ®Æt lªn mµng lai vµ ®Ó trong mét thiÕt bÞ chuyªn dông. Xö lý ¸nh s¸ng tö ngo¹i, N¬i xảy ra phản øng lai sÏ mang ho¹t tÝnh phãng x¹ (do cã mÆt mÉu dß), VÞ trÝ xảy ra phản øng lai sÏ ph¸t x¹ vµo phim. Tr¸ng phim sÏ thu ®­îc c¸c vÕt ®en t¹i n¬i ph¸t x¹ ®Þa ®iÓm lai. Southern Blot Technique Southern Blot Technique MOVIE_Southern Blot Ph­¬ng ph¸p Northern Blot Ph­¬ng ph¸p lai Northern Blot lµ ph­¬ng ph¸p lai ARN cña tÕ bµo víi mÉu dß ADN. VÒ mÆt nguyªn lý vµ c¸c b­íc tiÕn hµnh còng t­¬ng tù nh­ ph­¬ng ph¸p trªn. Phương pháp này cho biết Sự có mặt của mARN trong mô Mức độ thể hiện của gen Độ lớn của mRNA Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò Northern blot Western blot Lai Western Blot ®­îc thùc hiÖn giữa c¸c protein víi nhau dùa trªn nguyªn t¾c phản øng miÔn dÞch giữa kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ Phương pháp này cho biết: Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô Mức độ thể hiện của gen Độ lớn của protein Các bước tiến hành - Western Blot Mixture of protein molecules Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm So sánh 3 phương pháp lai Blot Type Matrix Molecule Detection Southern agarose DNA nucleic acid northern agarose RNA nucleic acid western polyacrylamide Protein antibody Các phương pháp lai khác Ph­¬ng ph¸p lai t¹i chç (insitu hybridzation) nh»m tìm ra ®o¹n ADN cÇn tìm (gen mong muèn) ngay trong tÕ bµo vµ m« Ph­¬ng ph¸p lai trªn khuÈn l¹c In situ hybridization Là kỹ thuật dùng để xác định số bản copy của một đoạn DNA đặc thù có mặt trong tế bào Thường sử dụng mẫu dò được đánh dấu huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization (FISH) hoặc động vị hoặc không đồng vị phóng xạ) DNA probes có thể lai với chromosome của tế bào ở metaphase hoặc interphase Mẫu dò ADN (DNA Probe) Mẫu dò phải có trình tự bổ xung với ADN mục tiêu 2 nguồn: Các loài có quan hệ họ hàng - heterologous probe Dịch ngược từ trình tự của protein Các trình tự có quan hệ về mặt tiến hóa Không giống hoàn toàn nhưng phải có tính tương tự Heterologous Probe Ví dụ dùng gen của nấm men để phân lập gen của người Mẫu dò từ các loài có quan hệ họ hàng Thiết kế mẫu dò để phát hiện một gen khi đã biết trình tự aa của protein Bảng mã di truyền Đánh dấu mẫu dò Đánh dấu mẫu dò với một cái ”đuôi” (tag) Sử dụng đồng vị phóng xạ: 32P, 35S, 125I, 3H. phát hiện bằng phóng xạ tự ghi Autoradiography hoặc Geiger-Muller counters. Phổ biến, có độ nhạy cao Không an toàn Đánh dấu không sử dụng phóng xạ Biotin (eg. avidin or streptavidin ). Enzymes (eg. alkaline phosphatase and horseradish peroxidase) Chemiluminescence (chemiluminescent chemicals) Fluorescence (FISH). Antibodies An toàn hơn Độ nhạy không cao