Kỹ thuật PCR xác định thành phần loài ký sinh trùng sốt rét

KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định thành phần loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) gây bệnh trên người tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng sinh học phân tử. Phương pháp: Kỹ thuật Nested PCR được áp dụng trong nghiên cứu này. Các cặp mồi được sử dụng là các cặp mồi đặc hiệu đối với từng loài Plasmodium. Kết quả và kết luận: phân tích 58 mẫu có KSTSR (+) tại xã Bù Gia Mập cho ta thấy có 4 loài KSTSR gây bệnh ở người, trong đó P. falciparum chiếm 60,9%; P. vivax chiếm 34,8%; P. malariae chiếm 2,9%; P. ovale chiếm 1,4%. Tỷ lệ nhiễm đơn P. falciparum chiếm 55,2%; nhiễm đơn P. vivax chiếm 24,1%; nhiễm đơn P. malariae chiếm 3,4%; nhiễm phối hợp 2 loài là 15,5%; nhiễm phối hợp 3 loài là 1,8%. ABSTRACT Objectives: In this study, we use the Polymerase Chain Reaction (PCR) to find out four human malaria parasite species. Methods: PCR is a highly sensitive method through which the presence of a particular DNA sequence in a given sample can be established. The oligonucleotide primer and original amplification conditions for Plasmodium species detection were developed and published by Snounou et al., 1995. Results and conclusions:Among 494 patient blood samples collected in Bu Gia Map commune–Bu Đang district - Binh Phuoc province from August to December, 2005, there were 58 malarial cases with 32 cases of single P. falciparum infection (55.2%), 14 cases of single P. vivax infection (24.1%), 2 cases of single P. malariae infection (3.4%) and 10 cases of mixed infection (P. falciparum + P. vivax + P. ovale) (17.3%). The Giemsa stain revealed mixed infection rate of only 8.7%. Ngày nay, một vấn đề mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là P. faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã làm biến dạng hình thái các chủng loại KST SR (Xét nghiệm kính hiển vi và sự nhầm chủng loại, Viện Sốt Rét KST- CT Trung Ương, 1965). Do đó, việc xác định đúng loài KSTSR đóng vai trò quan trọng trong điều trị. Hiện nay, đối với sốt rét, ngoài phương pháp nhuộm giêm sa phát hiện KST SR còn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như: nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck, Para-sight F ...và đặc biệt là kỹ thuật PCR. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật có độ nhạy cao, có khả năng phát hiện được những trường hợp có nhiễm KST mật độ thấp (5-10 KST/ml máu), phát hiện được 4 loài KSTSR gây bệnh trên người hoặc nhiễm phối hợp 2 hay nhiều loài, trong đó chỉ có một loài trội hẳn về số lượng mà kính hiển vi không thể phát hiện hay phân biệt được đầy đủ và chính xác(1,6). Trong chương trình sàng lọc KST SR để điều trị tiệt căn, sự ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định thành phần cơ cấu KST SR tại những vùng sốt rét lưu hành nặng là khả thi trong tình hình sốt rét hiện nay(5,7,8). Mục tiêu - Xác định thành phần loài và tỷ lệ nhiễm phối hợp KSTSR tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước bằng kỹ thuật PCR. - So sánh với phương pháp nhuộm Giemsa. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Địa điểm nghiên cứu Xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước nằm trong vùng sốt rét lưu hành nặng. Trong 6 tháng đầu năm 2004 có tỷ lệ lam dương tính/lam soi là: 25,04%, tỷ lệ mắc /1.000 dân là: 32,89. Vì vậy chúng tôi chọn địa điểm này để tiến hành nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu Tất cả những bệnh nhân đang sốt hay có sốt trong vòng 3 ngày trước đó. Thu thập mẫu Thời gian thu thập mẫu: Từ tháng 6/2005 đến tháng 12/2005. Phương pháp thu thập mẫu: Điều tra cắt ngang được tiến hành 3 đợt trên 9 thôn của xã Bù Gia Mập: Bù Nga, Thôn 8, Bù La, Bù Dốt, Đắk á, Bù Lên, Bù Lư, Bù Rên, Đắk Côn. Đợt 1 vào tháng 8/2005 được 416 lam, đợt 2 vào tháng 10/2005 được 720 lam và đợt 3 tháng 12/2005 được 141 lam. Tổng cộng 1.277 lam. Tất cả các lam đều được nhuộm giemsa. Trong đó 494 người (theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giới tính, tuổi, nghề nghiệp ....) được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấm Whatman 3MM để khô ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệt có đánh số thứ tự. Các mẫu này được tách chiết và phân tích bằng phương pháp PCR xác định thành phần KSTSR tại khoa SHPT của Viện. Phương pháp tách tinh khiết DNA Ap dụng phương pháp của Kain K.C, Lannar và cộng sự (1995) tách tinh khiết DNA bằng Chelex100. Phản ứng PCR (Khoa SHPT - Viện Sốt Rét KST-CT Trung Ương). Vật liệu Hóa chất dùng để tách chiết DNA của hãng Sigma Hoá chất dung cho phản ứng PCR: + dATP, dTTP, dCTP, dGTP (Abgene) + Tag polymerase (Abgene) + Primer (mồi): PLU5, PLU6 (Poligo), FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma) Lam kính, thuốc nhuộm giêmsa Giấy thấm Whatman 3MM Nested 1: Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium. Mồi sử dụng là Plu5, Plu6 Trình tự mồi: Plu5 5’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’ Plu6 5’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3’ Điều kiện phản ứng: 95oC – 5 phút (1 chu kỳ) 94oC – 1 phút 58oC – 2 phút 72oC – 2 phút (25 chu kỳ) 72oC – 8 phút (1 chu kỳ) Nested 2: Phản ứng PCR nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng loài. Trình tự mồi: FAL1 5’-TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3’ FAL2 5’-ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3’ VIV1 5’-CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC-3’ VIV2 5’-ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA-3’ MAL1 5’-ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC-3’ MAL2 5’-AAA ATT CCC ATG CAT AAA AAA TTA TAC AAA-3’ OVA1 5’-ATC TCT TTT GCT ATT TTT TAG TAT TGG AGA-3’ OVA2 5’-GGA AAA GGA CAC ATT AAT TGT ATC CTA GTG-3’ Thành phần phản ứng như Nested 1, chỉ khác DNA khuôn được lấy từ sản phẩm của Nested 1. Điều kiện phản ứng như Nested 1, chỉ khác từ bước 2 đến bước 4 được lặp lại 30 chu kỳ. Bảng 1: Kích thước sản phẩm PCR Phản ứng PCR (Nested 2) Kích thước sản phẩm PCR P. falciparum 205 bp P. vivax 120 bp P. malariae 144 bp P. ovale 800 bp Phương pháp phân tích kết quả Sản phẩm PCR được phân tích kết quả bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose 2% có chứa ethidium bromide. Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu từng loài như bảng1. KẾT QUẢ Tổng số mẫu thu thập được từ xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước là 494 mẫu. Số mẫu phân tích bằng kỹ thuật Nested PCR là 494 mẫu. Kết quả có 58 mẫu (+). Thành phần cơ cấu va tỉ lệ nhiễm phối hợp KST (xem bảng 2). Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của những bệnh nhân nhiễm đơn P. falciparum, nhiễm đơn P. vivax, nhiễm đơn P. malarie, nhiễm phối hợp 2 loài, nhiễm phối hợp 3 loài được biểu hiện trên các hình 1, 2, 3, 4 và 5. Dựa vào Bảng 1, ta thấy trên hình ảnh điện di kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu cho từng loài Plasmodium. Hình 1: Hình ảnh điện di nhiễm đơn P. falciparum (Hoàng Thị Huệ, 5 tuổi, Đắk á) Hình 2: Hình ảnh điện di nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax và P. ovale (Đa Thị Nhàn, 5 tuổi, Bù Nga) Bảng 2: Thành phần loài KST tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước. Nhiễm đơn n (%) Phối hợp n (%) Tổ ng số P. f P. v P. m P.f+ P.v P.f+P.v +P.o Nest ed PCR 32 (55 ,2) 14 (24 ,1) 2 (3 ,4) 9 (15, 5) 1 (1,8) 58 Gie msa 35 (60 ,3) 17 (29 ,3) 1 (1 ,7) 5 (8,7) 0 (0) 58 Bảng 2 cho thấy tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước có sự tồn tại 4 loài KSTSR (P. falciparum, P. vivax, P. malarie, P. ovale). Trong đó, tỷ lệ nhiễm đơn P. falciparum là cao nhất (55,2%). Bảng 3: Tỷ lệ thành phần loài KSTSR tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước. P.f (%) P.v (%) P.m (%) P.o (%) Tổng cộng (%) Nested PCR 42 (60,9) 24 (34,8) 2 (2,9) 1 (1,4) 100 Giemsa 40 (63,5) 22 (34,9) 1 (1,6) 0 (0) 100 Theo bảng 3 so sánh giữa Nested PCR và Giemsa ta thấy không có sự khác biệt nhiều về tỷ lệ thành phần loài giữa 2 kỹ thuật này (p= 0,87 > 0,05). Trong 58 ca (+) có 6 ca có sự khác biệt giữa Nested PCR và Giemsa (Bảng 4). Bảng 4: Đối chiếu kết quả giữa 2 phương pháp nhuộm giêmsa và PCR. Mã số bệnh nhân Kết quả Giemsa Kết quả Nested PCR 1 (Thị Hạnh, 8 tuổi, Bù La) Vtg+++ P. f + P.v 55(105)(Điểu Han, 7 tuổi, Đắk á) Vt(+) P. m 1095(Điểu Hiệp, 8 tuổi, Bù La) Vt(+) P. f + P.v 3524 (Phan Thanh Tường, 25 tuổi, Bù Lư) Ft+ P. f + P.v 3561 (Nguyễn Văn Khang, 18 tuổi, Bù Rên) Ft++ P. f + P.v 75A(Đa Thị Nhàn, 5 tuổi, Bù Nga) Ft+g(+) P. f + P. v + P.o NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN - Trong tổng số 58 ca KSTSR (+) lấy được tại xã Bù Gia Mập, huyện Phước Long, tỉnh Bình Phước, chúng tôi thấy có tất cả 4 loài KSTSR (P. falciparum, P.vivax, P.malarie, P.ovale). Tỷ lệ P.falciparum chiếm cao nhất 60,9%, kế đến là P.vivax 34,8%. - Về cơ cấu KSTSR, tỷ lệ nhiễm đơn P. falciparum là 55,2%; tỷ lệ nhiễm đơn P. vivax là 24,1%. Tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 loài P. falciparum và P. vivax là 15,5%. - Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy không có sự khác biệt nhiều giữa 2 kỹ thuật Giemsa và Nested PCR (p= 0,86 > 0,05) về cơ cấu KST SR. Tuy nhiên trong số 58 ca KSTSR (+) có 6 ca có sự khác biệt giữa kết quả Giemsa và Nested PCR. Chỉ có 1 ca kết quả Giemsa là P. vivax nhưng Nested PCR là P. malariae. Còn lại 5 ca là thiếu loài trong nhiễm phối hợp (Bảng 4). Có thể là trong nhiễm phối hợp có 1 loài trội hơn còn loài kia mật độ quá thấp, dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi. Theo nghiên cứu “Áp dụng các kỹ thuật SHPT để nghiên cứu thành phần cơ cấu loài của KSTSR tại tỉnh Quảng Bình 2004-2005” của Lê Đức Đào và cộng sự cho thấy so với kỹ thuật nhuộm Giem sa, kỹ thuật PCR phát hiện được tỷ lệ nhiễm phối hợp cao hơn (30% so với 4,6%). Còn lại 436 mẫu Giemsa (- ) thì Nested PCR cũng có kết quả (-)(5). - Kỹ thuật PCR là kỹ thuật có tính chính xác nhưng đòi hỏi mức độ chuyên hóa cao và chi phí tốn kém tuy nhiên nó cũng góp phần vào việc tìm biện pháp phòng chống sốt rét có hiệu quả.