Luận văn Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biến ASP trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ Tandem LC-MS/MS

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ____________________ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2009 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _____________________ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS Chuyên ngành : Hoá phân tích Mã số : 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT Hà Nội - Năm 2009 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn này được thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM với sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Hùng Việt. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng Việt đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Dương Hồng Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè và đồng nghiệp đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, cùng các thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm luận văn. Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Học viên Đinh Đăng Huy i MỤC LỤC MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1 Chương 1 - TỔNG QUAN...............................................................................................4 1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ ...................................................................................4 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản..................................................................6 1.3. Đại cương về axít domoic (DA)........................................................................8 1.3.1. Tính chất hóa lý. .......................................................................................8 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: ........................................................8 1.3.3. Độc tính của DA .......................................................................................9 1.4. Một số phương pháp phân tích DA...................................................................9 1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................10 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS)..11 1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA.............................................................12 1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột............................................................12 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................12 1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] ........................12 1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản.............................................13 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) ..............15 1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng ................................23 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột............23 1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký...................................................26 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: ....................................................................................27 1.7.2. Chiết pha rắn SPE: ..................................................................................27 Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................29 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài.......................................................................29 2.2. Mô hình thực nghiệm ......................................................................................29 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: .............................................................................29 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: ....................................................................................29 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: ...............................................................................30 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu:.........................................................................30 2.5. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................31 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS.....................................................31 2.5.2. Cột:..........................................................................................................31 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: ..................................................................32 2.5.4. Dung môi chiết:.......................................................................................32 2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: ................................................................................32 2.5.6. Tính toán : ...............................................................................................33 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: ...................................................................33 2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .....................................................33 2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: ...................................................................34 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp:................................................................34 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể..................................35 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................36 3.1. Xác định các thông số tối ưu:..........................................................................36 3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS ..............................................36 ii 3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. ...............................................40 3.1.3. Dung môi chiết:.......................................................................................45 3.2. Khoảng tuyến tính: ..........................................................................................47 3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .............................................................49 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .....................................................49 3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể. ...................................................51 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp:............................................................52 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. ....................................................................54 3.7.1. Phạm vi áp dụng: ....................................................................................54 3.7.2. Nguyên tắc: .............................................................................................54 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch:...................................................54 3.7.4. Chuẩn bị mẫu: .........................................................................................57 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: ............................................................................58 3.7.6. Đảm bảo chất lượng................................................................................60 3.7.7. Tính toán kết quả: ...................................................................................60 KẾT LUẬN....................................................................................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................62 PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN...................1 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU...........................4 PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH ......................................13 PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ ...........19 PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ ………….BẰNG HPLC –UV ........................................................................29 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt DA Axít domoic Axít Domoic DAD Diot Array Detector Đầu dò Diot Array EU European Liên minh Châu Âu FA Formic acid Axít Formic FLD Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng NPLC Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận ND Not detected Không phát hiện RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn TFA Trifluoroacetic acid Axít Trifluoro axetic UV Ultra Violet Cực tím VIS Visible Nhìn thấy iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diễn giải Trang Bảng 01. Một số dung môi sử dụng trong HPLC .....................................................26 Bảng 02. Chi tiết mẫu thực nghiệm ..........................................................................30 Bảng 03. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế mao quản........................................36 Bảng 04. Kết quả khảo sát giá trị hiệu điện thế cone................................................37 Bảng 05. Kết quả khảo sát năng lượng va chạm.......................................................38 Bảng 06. Các Ion thứ cấp và các điều kiện tối ưu của năng lương va chạm ............39 Bảng 07. Điều kiện gradient 1– pha động 1.............................................................40 Bảng 08. Bảng gradient 2 – pha động 1....................................................................41 Bảng 09. Bảng gradient 1 – pha động 2....................................................................42 Bảng 10. Bảng gradient 2 – pha động 2....................................................................43 Bảng 11. Bảng gradient 3 – pha động 2....................................................................44 Bảng 12. So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 ở nồng độ 2 ppm ...........................47 Bảng 13. Bảng tổng hợp thông số về độ tuyến tính theo các ion: Error! Bookmark not defined. Bảng 14. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ............................49 Bảng 15. Kết quả phân tích độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. ...................49 Bảng 16. Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể (tính trên Ion 266,25) ........................51 Bảng 17. So sánh kết quả phương pháp HPLC-UV và LC-MS/MS.........................53 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Diễn giải Trang Hình 01. Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng...................................................16 Hình 02. Sơ đồ van cao áp ở vị trí nạp......................................................................17 Hình 03. Sơ đồ van cao áp ở vị trí tiêm ....................................................................17 Hình 04. Pha tĩnh của cột sắcký pha đảo. .................................................................18 Hình 05. Pha tĩnh của cột sắc ký pha thuận. .............................................................19 Hình 06. Bộ kết nối phun điện tử ..............................................................................20 Hình 07. Bộ ion hóa hóa học.....................................................................................20 Hình 08. Hệ thống đầu dò tứ cực ..............................................................................22 Hình 09. Nguyên lý hoạt động của đầu dò MS/MS..................................................23 Hình 10. khả năng tách của cột C8 và C18. ..............................................................24 Hình 11. Ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng tách của chất.........................24 Hình 12. Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đối với quá trính sắc ký. ..............25 Hình 14. Mô hình thực nghiệm.................................................................................29 Hình 15. Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = 2 KV.....................................37 Hình 16. Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V...............38 Hình 17. Cách phân mảnh ion của DA .....................................................................39 Hình 18. Sắc ký đồ ở điều kiện Collision energy 15 eV...........................................40 Hình 19. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 1 ....................................41 Hình 20. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 1 ....................................42 Hình 21. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 2 ....................................43 Hình 22. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 2 ....................................44 Hình 23. Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 2 ....................................45 Hình 24. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH:H20: 1:1 ......................46 Hình 25. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93..46 Hình 26. Sắc ký đồ chạy mẫu chiết bằng dung môi MeOH: H20: 2:1 .....................47 Hình 27. Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .............................................................48 Hình 28. Kết quả chạy mẫu nghêu tại Nam Định trên LC-MS/MS và HPLC-UV...53 Hình 29. Kết quả chạy mẫu CRM trên LC-MS/MS và HPLC-UV ..........................54 1 MỞ ĐẦU Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm 2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD. Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu, để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích. Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên 2 quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ). Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có công thức cấu tạo: Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine đối với họ cá thu ngừ…). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC- UV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường … ) là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất khẩu. Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại 3 phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam. 4 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ Trong các hệ sinh thái thủy vực, các loài vi tảo là những sinh vật sản xuất sơ cấp đồng thời còn là nguồn dinh dưỡng chủ yếu của nhiều loài động vật phù du, ấu trùng tôm cua, một số loài thân mềm ăn lọc và cá, v.v. Phần lớn các loài vi tảo là có lợi cho các sinh vật thủy sinh. Tuy vậy, một phần nhỏ trong chúng, với khoảng 100 trong tổng số trên 5.000 loài tảo phù du đã được phát hiện trên thế giới thuộc tảo khuê (Bacillariophyta), tảo giáp (Dinoflagellata), các tảo có roi khác và vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa các độc tố gây hại cho sinh vật khác. Các loài tảo và vi khuẩn có chứa các sắc tố màu khác nhau, sống trôi nổi, dưới những điều kiện môi trường nhất định có thể sinh trưởng thành các quần thể to lớn ở vùng ven bờ gây nên sự đổi màu nước. Sự đổi màu nước tự nhiên thành mầu đỏ, nâu, vàng nâu nhạt (màu hổ phách) hoặc xanh vàng ở các vùng nước rộng lớn diễn ra là kết quả của sự nở hoa (Algal blooms) của các loài vi tảo và vi khuẩn lam trong thủy vực. Ví dụ: màu đặc trưng của Biển Đỏ gây nên bởi sự nở hoa của vi khuẩn lam Oscillatoria erythraeum có chứa các sắc tố đỏ phycoerythrin ... “Thủy triều đỏ” là sự sinh trưởng mạnh mẽ của các loài phù du nào đó gây ra làm đổi màu nước. Các loài này có thể sản sinh ra độc tố gây chết tôm, cá, thân mềm và con người ăn phải cũng bị ngộ độc và có thể bị tử vong. Hiện tượng nở hoa của tảo độc hại (Harmful Algal Blooms) là các sự kiện mà tại đó sự tăng mật độ của một hoặc một số loài tảo độc hại đạt tới mức có thể gây nguy hại tới các sinh vật khác. Người ta chia hiện tượng nở hoa của tảo độc hại thành một số loại sau: a. Các loài không chứa độc tố nhưng khi nở hoa làm thay đổi màu nước; dưới những điều kiện đặc biệt chẳng hạn như trong cá