Luận văn Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cửa (phyllanthus urinaria L.euphorbiaceae)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ NGÔ ĐỨC TRỌNG NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L., EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- NGÔ ĐỨC TRỌNG NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L., EUPHORBIACEAE) Chuyên ngành : Hoá hữu cơ Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Phạm Văn Thỉnh - Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn . Tôi xin chân trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, Th.S. Vũ Anh Tuấn, Th.S Hứa Văn Thao những người thầy đã động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn phòng hoạt chất sinh học của trường Đại học Y Thái Nguyên và cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm của Bác sĩ Hoàng Sầm, phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi cũng xin chân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008 Tác giả Ngô Đức Trọng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả NGÔ ĐỨC TRỌNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN SKLM : Sắc kí lớp mỏng UV : Ultraviolet spectrocopy MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation HIV : Human Immunodeficiency Virus đvC : Đơn vị Cacbon DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)…………………………...……….26 Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa…………………27 Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)…………………...………………...…..29 Bảng 2.4: Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1 trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)…………………...………...….30 Bảng 2.5: Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất PE-3…………..……………….32 Bảng 3.1: Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của -sitosterol [15]….…..40 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của 5-hidroxymetylfufural................................................44 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của PE-2 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của axit gallic....................................................................48 Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của PE-3 và số liệu phổ trong phần mềm ACD/NMR của chất kampherol...........................................................52 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae............. 3 Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phƣơng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch....................................................28 Hình 3.1: Phổ FT-IR của -sitosterol (PH-1).......................................................36 Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của -sitosterol (PH-1)..................................................37 Hình 3.3: Phổ 13 C-NMR và ATP của -sitosterol (PH-1)....................................38 Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR-DMSO của PE-1...........................................................42 Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR-DMSO của PE-1..........................................................43 Hình 3.6: Phổ 1 H-NMR-DMSO của PE-2...........................................................46 Hình 3.7: Phổ 13 C-NMR-DMSO của PE-2..........................................................47 Hình 3.8: Phổ 1 H-NMR-AcetoneD6 của PE-3.....................................................50 Hình 3.9: Phổ 13 C-NMR-AcetoneD6 của PE-3....................................................51 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu...................................................................26 MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các bảng Danh mục các hình và sơ đồ MỞ ĐẦU ........................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................................3 1.1. Mô tả thực vật ............................................................................................3 1.2. Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus ........................................................4 1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus ......................................................4 1.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý của chi Phyllanthus .............................................5 1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus ..........................6 1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit ..........................................................6 1.3.2 Một số đại diện của khung axit..................................................................8 1.3.3 Một số đại diện của Lignan .......................................................................9 1.3.4 Một số đại diện của khung flavonoit........................................................11 1.3.5 Một số hợp chất phenolic khác ................................................................12 1.3.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit ...............................................................15 1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus urinaria L....................16 CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM..........................................................................23 2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................23 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu ..............23 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ..............................23 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ............24 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ...................................................24 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ..............................................................................24 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu................................................................................25 2.3. Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)..................25 2.3.1. Các dịch chiết .......................................................................................25 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết ............................................................27 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học ...........................................................................27 2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ ....................................................................29 2.4.1. Dịch chiết n-hexan ................................................................................29 2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (PE) .............................................................31 2.4.2.1 Chất PE-1............................................................................................31 2.4.2.2 Chất PE-2............................................................................................31 2.4.2.3 Chất PE-3............................................................................................32 CHƢƠNG III. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................34 3.1. Nguyên tắc chung ....................................................................................34 3.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên............................................34 3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất ..........................................................35 3.3.1. -sitosterol (PH-1).................................................................................35 3.3.2. 5-Hydroxymetylfufural (PE-1) ...............................................................41 3.3.3. Axit gallic (PE-2) ..................................................................................45 3.3.4. Kampherol (PE-3) .................................................................................49 3.4. Thử hoạt tính sinh học ..............................................................................53 KẾT LUẬN.................................................................................................... 55 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .... .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................57 PHỤ LỤC .......................................................................................................62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người. Từ trước khi có sự ra đời của thuốc tây, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên đã được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh và rất có hiệu quả. Rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ thảo dược. Ngày nay những hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh. Điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc cũng ngày càng tăng lên, được khoa học hiện đại soi sáng, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp. Mặt khác việc dùng thuốc nam hầu như không gây ra tác dụng phụ. Có nhiều bộ môn khoa học nghiên cứu về cây thuốc ra đời. Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc. Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn để làm thuốc chữa bệnh. Cây chó đẻ răng cưa là một cây thuốc đã được sử dụng từ lâu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Trong Y học dân tộc cây này được nhân dân dùng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh như: đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, bệnh viêm gan,… rất có hiệu quả. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Thực vật chó đẻ răng cưa có nhiều ứng dụng quan trọng nhưng gần đây mới được các nhà khoa học các nước quan tâm chọn làm đối tượng nghiên cứu, còn ở nước ta hiện có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và dược lí học của cây chó đẻ răng cưa. Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học của cây chó đẻ răng cưa, góp phần làm tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của Việt Nam. Chúng tôi chọn cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) làm đối tượng nghiên cứu cho công trình nghiên cứu này. Tên đề tài là: “Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L., Euphorbiaceae)”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật Cây chó đẻ răng cưa còn gọi là diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, cam kiềm, rút đất, khao ham (Tày), prakphle (Campuchia). Tên khoa học là: Phyllanthus urinaria L, thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae). Phân bố địa lý: Cây chó đẻ răng cưa phân bố rộng khắp ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, điển hình như: Thái Nguyên, Bắc Ninh, Nghệ An, Hà Giang,… Trên thế giới loại cây này mọc nhiều ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Inđonexia, Myanma, Thái Lan,… Châu Mĩ như: Brazil, Argentina,…[5]. Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển: Cây chó đẻ răng cưa là một loại cỏ mọc hàng năm, cao chừng 30 cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành, thường có màu đỏ hơi tía. Cây có vị hơi ngọt. Lá mọc so le lưỡng hệ hay có cuống rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, đơn tính, màu đỏ nâu. Hoa đực và hoa cái cùng gốc. Hoa đực ở đầu cành, hoa cái ở cuối cành. Hoa không có cuống hoặc có cuống rất ngắn. Quả nang không cuống hình cầu hơi dẹt. Đường kính quả có thể đạt tới 2mm. Hạt ba cạnh hình trứng màu nâu nhạt có vân ngang [5]. 1.2. Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng rộng rãi trong y học dân tộc của nhiều nước để chữa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan B…[7]. Các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là 3 loài Phyllanthus urinaria L, Phyllanthus niruri L và Phyllanthus amarus Schum et Thonn [4]. Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) [6]: Chữa viêm gan do virus: Chó đẻ đắng sao khô 20g, sắc nước 3 lần. Trộn chung các nước sắc. Thêm 50g đường, đun sôi cho tan đường. Chia làm 4 lần uống trong ngày. Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc. Chữa xơ gan cổ trướng thể năng: Chó đẻ đắng sao khô 100g sắc nước 3 lần. Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30-40 ngày. Khẩu phần ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ). Riêng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) trong y học dân tộc được nhân dân dùng để chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn rất có hiệu quả. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) [5], [6]: Nhân dân ta thường dùng toàn cây hái về làm thuốc, mùa thu hái quanh năm nhưng tốt nhất là vào mùa hạ. Thường dùng tươi có khi phơi khô, ngày uống 20-40g cây tươi, sao khô, sắc đặc, uống thay nước. Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Chó đẻ răng cưa sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g. Sắc nước uống hàng ngày. Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi dã nát với một ít muối đắp ngoài da với liều lượng không hạn chế. 1.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý của chi Phyllanthus Năm 1961, phòng Đông Y Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga (1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm). Năm 1977, một nhóm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hoá, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của Lương y Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là chó đẻ đắng, xuyên tâm liên, quả dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HBsAg (+). Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi. Tỷ lệ đạt 26/98 bệnh nhân. Ngoài ra, thuốc còn giúp cơ thể người dùng sản xuất kháng thể chống HBsAg (59/98 người). Liều điều trị trung bình 4-5 tháng [6]. Năm 1988 các tác giả Blunberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37 bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng chó đẻ răng cưa Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri đạt kết quả âm tính 22/37 bệnh nhân sau 30 ngày. Các tác giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [5]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng tại Bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội), đã sử dụng chế phẩm LIV/94 (chó đẻ răng cưa là một trong 3 thành phần chính của thuốc) điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002) đạt kết quả tốt. Thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân [6]. Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus đã phát hiện một vài lignan, flavonoit và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV transcriptase ngược [21]. Các thí nghiệm in vitro của cây chó đẻ với kháng nguyên HBsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh cây chó đẻ có khả chống virus viêm gan B. Cây chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Coli, Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [1]. 1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus Cho đến nay người ta đã phát hiện chi Phyllanthus L. họ thầu dầu (Euphorbiaceae) có 700 loài, gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [11]. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L. (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus niruri L. (chó đẻ thân xanh) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (chó đẻ đắng hay diệp hạ châu đắng). 1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit Từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5 tritecpen mới, cấu trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 (29)-en-3β,24-diol; olean-12-en-3β,24-diol; oleana-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en- 3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpen diol betulin [33]; lup-20(29)- en-3β,15α-diol [41]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Theo [39], từ loài Phyllanthus oxyphyllus đã tách được: 29-nor-3,4- seco-friedelan tritecpen (axit 29-nor-3,4-seco-friedelan-4(23),20(30)-dien-3- oic) và một secquitecpen mới là guaiane secquitecpen (5-hydroxy-6,9- epoxyguaiane). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ thử nghiệm IC50 = 0.017 ± 0.001 mM. HOOC HO O 1. 29-nor-3,4-seco-friedelane tritecpen 2. Guaiane secquitecpen Từ loài Phyllanthus reticulates đã phân lập được một hợp chất mới là 21α-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one và một vài triterpenoit khác, đã biết đó là: friedelin, sitosterol, friedelan-3β-ol, glochidonol và 21α-hydroxyfriedelan - 3 - on [47]. Theo tài liệu [46], từ loài Phyllanthus plyanthus ở Châu Phi các tác giả đã tìm ra được một số tritecpenoit: phyllanthol, phyllanthone, (20S)-3β- acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, δ-amyrin acetate, lupenone và (20S)- 3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol. H HO CH3OCO H H H 3. (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 Từ loài Phyllanthus acidus đã tách được hai pentacyclic tritecpenoit,