Một số kỹ thuật kiểm tra hiện đại

MỘT SỐ KỸ THUẬT KiỂM TRA HIÊN ĐẠI ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Kỹ thuật ELISA?  Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử đặc trưng trong mẫu (e.g. proteins & carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố...)  Là công nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử dụng kháng thể (antibodies).  Dùng để định tính và định lượng mẫu.  Rất nhạy.  Được ứng dụng nhiều trong y học và thực phẩm  Có khả năng phát hiện và liên kết với kháng nguyên (antigens) Antibodies  Là những Proteins được tiết ra bởi tế bào B- lymphocytes (bạch cầu) ở động vật có xương sống. IgG molecule Fab fragments Fc fragments Các bước cơ bản của phương pháp ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay 1. Antigen được hấp thu trên bề mặt plastic (‘sorbent’). 2. Antigen được nhận biết bởi các antibody đặc trưng (‘immuno’). 3. Antibody được nhận diện bởi antibody (‘immuno’) thứ 2 có gắn với enzyme (‘enzyme-linked’). 4. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện (thường tạo hợp chất màu) Màu của sản phẩm= đo được sự hiện diện của antigen Substrate Primary antibody Secondary antibody Different antigens in sample Coloured product Botrytis cinerea conidiophore Chuẩn bị mẫu Place half a raspberry in tube Add 2ml PBS Break up tissue with glass rod Filter into new tube using muslin Coating the wells  Nhỏ 1 giọt mẫu vào giếng (well)  Giữ yên trong khoảng 10 phút để mẫu hấp thu vào bề mặt plastic. Thêm kháng thể (primary antibody)  Thêm vào khoảng 4 giọt primary antibody (mouse monoclonal) vào mỗi giếng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) Fuse B-lymphocytes with myeloma cells Inject mouse with antigen Grow mouse myeloma (tumour) cells in culture Obtain Mouse spleen B-lymphocytes Antibody-producing hybridoma cells Unlimited supply of antibody specific for single epitope Keep clone producing antibody which best detects antigen Screen hybridomas for antibody production Select fused and reproducing hybridoma cells via growth medium B-lymphocyte and myeloma mixture Make clones from individual antibody- producing cells Sản xuât kháng thể thứ hai (Secondary antibody) Mouse serum injected into a different species, e.g. rabbit, goat. Animal makes various antibodies against the different antigens in serum Take blood from animal Select anti-mouse antibodies from plasma Polyclonal antibodies which can recognise any mouse antibody Thêm vào kháng thể thứ 2 secondary antibody  Được liên kết với enzyme horseradish peroxidase.  Thêm vào 4 giọt secondary antibody (anti- mouse polyclonal) vào mỗi giếng  Để yên trong khoảng 20 phút. 1. Add antigen 7. Add substrate for enzyme 2. Wash with PBST 4. Wash with PBST 3. Add primary antibody 6. Wash with PBST 5. Add secondary antibody 8. Observe colour development Ứng dụng ELISA  Phát hiện bệnh ở người, động vật và thực vật.  Phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong thực phẩm.  Phát hiện các hormones, kháng sinh trong thực phẩm.  Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ PCR KHÁI NIỆM • PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction • PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại gen". • PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. • PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống LỊCH SỬ Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase THỰC NGHIỆM PCR • PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. • PCR cần rất nhiều thành phần. - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi (primer), - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA- polymerase THỰC NGHIỆM PCR PCR machine Chu kỳ nhiệt: Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Nguyên tắc PCR 1 2 3 4 n 2n DNA đích 1 Biến tính (94oC ) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o C) 5’ 3’ 3’ 5’ 1. Đoạn mồi Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) Mồi Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 PCR MIX DNA đích (Template) 2. Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 45 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. - Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. - Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min Phát hiện  qua kích thước (điện di)  hay qua trình tự (lai) Ct curve Standard curve Melt curve Real-time PCR chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại Laser or UV Camera Thiết bị Real-time PCR Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 Real-time PCR MIX Target DNA (Template) Real-time PCR mix Chất phát huỳnh quang Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc kieåu gen Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen Nuoâi caáy PCR PCR có đặc hiệu không? PCR đặc hiệu tương đương nuôi cấy Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật Mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử Tách chiết nucleic acid Chạy PCR Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực Những ứng dụng của PCR • Vân tay di truyền • Kiểm tra huyết thống • Chuẩn đoán bệnh di truyền • Tách dòng gen • Gây đột biến điểm • Phân tích mẫu DNA cổ • Xác định gen của các đột biến • So sánh mức độ biểu hiện của gen