Một số phương pháp xác định dòng cần tìm

Một số phương pháp xác định dòng cần tìm 1. Phương pháp lai axit nucleic - Khái niệm đầu dò: Các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu, có khả năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa. - Đặc điểm của đầu dò: Là một đoạn axit nucleic (DNA hoặc RNA) sợi đơn. Đầu dò phải bổ sung các bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ. - Các loại đầu dò: cDNA làm đầu dò cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide cũng có thể làm đầu dò. Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với DNA đã nghiên cứu và từ đó tổng hợp đầu dò. Còn nếu một phần DNA phải so mốc đã biết thì công việc rất dễ dàng để tổng hợp một đầu dò. - Nguyên tắc của phương pháp lai axit nucleic: Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của DNA. Khi tăng nhiệt độ của DNA lên quá nhiệt độ sinh lý (thường ở khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại. Sự bắt cặp chỉ có thể xảy ra khi hai trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau. Tính đặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nào cũng tìm gặp mạch bổ sung với nó, mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình tự DNA và RNA khác nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai. - Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA. 2. Phương pháp sử dụng kháng thể - Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa. - Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein). Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể. - Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần phải có kháng thể đặc trưng. 3. Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh. Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR322 . Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc AmPR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng. Ưu điểm của phương pháp là ít tốn kém so với phương pháp lai. 4. Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình - Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc đó có chứa gen lạ. - Cách tiến hành: Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa gen lacZ (ví dụ như dãy pUC), một mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ. Sau đó, nuôi cấy cả hai mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5 brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside). Chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X (dẫn xuất indol), ngoài môi trường, dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm. Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase. Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.