Ngân hàng cDNA

Ngân hàng cDNA 1. Thiết kế ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một tế bào. Như vậy, ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định (tế bào biệt hóa), vì thế, cDNA mang tính tế bào rất cao. Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước sau đây: - Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn những tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đó, làm sạch mRNA. - Chọn lựa các mRNA chứa nhiều A (polyA) bằng cách tách trên cột xenlulose oligo dT. - Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman. - Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi) được nhận biết bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI. - Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa). Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp. - Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử nhóm phosphat, - Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp, - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp để tạo dòng, - Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA. Mục đích của việc thiết lập ngân hàng cDNA là nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen cũng như mối tương tác giữa các gen trong một quá trình sống. Chú ý: Khi phân tích kết quả thu được ngân hàng cDNA, cần chú ý tác dụng sinh lí từng thời điểm thí nghiệm. 2. Sàng lọc ngân hàng cDNA Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA được bắt đầu từ việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA. DNA plasmid từ mỗi mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro- xenlulose (màng lai) sẽ bị biến tính và lai với mRNA tổng số. Mỗi mRNA khác nhau sẽ được lai trên nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung của nó. Các mRNA bám vào màng lọc được tách ra và dùng để tổng hợp protein mà nó mã hóa bằng hệ thống dịch mã invitro. Protein hình thành được đem phân tích xem có phải là sản phẩm của mRNA cần tìm hay không, và từ đó, xác định vi sinh vật nuôi cấy chứa gen mong muốn. Sàng lọc tất cả các mẻ nuôi cấy theo cách trên để xác định dòng đơn thể hiện gen tìm kiếm. Ngân hàng gen (Genomic library) Ngân hàng bộ gen của một sinh vật là tập hợp các trình tự DNA cấu thành bộ gen được gắn vào vector, nó chỉ biểu diễn tổng số của gen. Ngân hàng này được tạo ra từ một bộ sưu tập DNA tái tổ hợp cả các chuỗi mã hóa lẫn các chuỗi không mã hóa. Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng bộ gen có thể được thiết lập bất kỳ loại tế bào nào của sinh vật nghiên cứu. Các bước thiết lập ngân hàng gen: - Tách và làm sạch DNA của sinh vật - Cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định bằng enzyme RE loại II - thông thường, người ta sử dụng EcoRI, - Vector được chọn để tạo dòng gen thường là cosmid hoặc phage λ cũng được xử lý bởi EcoRI, - Tạo vector tái tổ hợp và đóng gói trong vỏ phage - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và tạo dòng, - Xác định đặc tính và biểu hiện của dòng vi khuẩn vừa lập - Tiến hành sàng lọc, nghĩa là phải tách những vector nào có đoạn DNA ưa chuộng, từ đó xây dựng ngân hàng bộ gen. Đặc điểm và ứng dụng: - Ngân hàng gen chứa các đoạn DNA lớn hơn 100 lần so với cDNA. - Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trúc intron và exon của một gen xác định. - Tạo dòng những trình tự DNA không mã hóa nằm cạnh các gen mã hóa và đóng vai trò quyết định trong sự điều hòa biểu hiện của gen. Một số phương pháp xác định dòng cần tìm 1. Phương pháp lai axit nucleic - Khái niệm đầu dò: Các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu, có khả năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa. - Đặc điểm của đầu dò: Là một đoạn axit nucleic (DNA hoặc RNA) sợi đơn. Đầu dò phải bổ sung các bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ. - Các loại đầu dò: cDNA làm đầu dò cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide cũng có thể làm đầu dò. Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với DNA đã nghiên cứu và từ đó tổng hợp đầu dò. Còn nếu một phần DNA phải so mốc đã biết thì công việc rất dễ dàng để tổng hợp một đầu dò. - Nguyên tắc của phương pháp lai axit nucleic: Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của DNA. Khi tăng nhiệt độ của DNA lên quá nhiệt độ sinh lý (thường ở khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại. Sự bắt cặp chỉ có thể xảy ra khi hai trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau. Tính đặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nào cũng tìm gặp mạch bổ sung với nó, mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình tự DNA và RNA khác nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai. - Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA. 2. Phương pháp sử dụng kháng thể - Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa. - Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein). Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể. - Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần phải có kháng thể đặc trưng. 3. Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh. Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR322 . Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc AmPR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng. Ưu điểm của phương pháp là ít tốn kém so với phương pháp lai. 4. Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình - Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc đó có chứa gen lạ. - Cách tiến hành: Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa gen lacZ (ví dụ như dãy pUC), một mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ. Sau đó, nuôi cấy cả hai mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5 brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside). Chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X (dẫn xuất indol), ngoài môi trường, dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm. Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase. Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.