Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid từ lá chè xanh, trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 285 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TỪ LÁ CHÈ XANH, TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Đoàn Thanh Huyền1*, Lê Minh Trí2, Ngô Thị Thúy Phương1 Tóm tắt: Các hợp chất flavonoid được tiến hành tách chiết từ lá chè xanh, lá trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên các dòng vi khuẩn kiểm định: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans và Staphycoccus aureus. Sau khi đã tối ưu được quy trình tách chiết lá chè xanh và lá trầu không để sản xuất hợp chất flavonoid từ các nguồn nguyên liệu trên với các thông số kỹ thuật như: dung môi chiết là ethanol và ethylacetate và dung môi n-hexan trong 3 giờ, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1, nhiệt độ 50C. Kết quả chỉ ra rằng, hoạt chất flavonoid tách ra từ lá chè xanh, lá trầu không đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với 2 chủng E. coli và S. aureus với các đường kính kháng khuẩn từ 0,5 cm đến 1,5 cm. Hoạt chất flavonoid được tách chiết từ lá trầu không có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với hoạt chất từ lá trà xanh. Hoạt tính kháng khuẩn được tăng lên rất nhiều sau khi chuyển dịch chiết sang dạng nano với đường kính kháng khuẩn từ 3,1 cm. Từ khoá: Bacillus subtilis; Candida albicans; Escherichia coli; Staphycoccus aureus; Hoạt tính kháng khuẩn; Hợp chất flavonoid. 1. MỞ ĐẦU Cây chè là một trong những sản phẩm nông nghiệp chủ yếu của đất nước ta. Theo thống kê của Tổng cục Hải quan, trong khoảng 5 năm gần đây, kim ngạch xuất khẩu chè bình quân của Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD. Tuy nhiên, sự phát triển của cây chè và các sản phẩm từ chè Việt Nam chưa tương xứng với tiềm năng của nó [2]. Do vậy, cần đẩy mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đồng thời cần nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao (Flavonoid) nhằm ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè. Một số nghiên cứu đã chứng minh hàm lượng polyphenol trong lá chè biến động mạnh theo mùa và theo tuổi lá. Bước đầu nghiên cứu thăm dò về một số hoạt tính sinh học của chế phẩm flavonoid chiết xuất từ lá chè nhận thấy: chế phẩm có khả năng chống oxy hóa cao, tác dụng bảo vệ gan trên chuột bị nhiễm độc CCl4, có tác dụng kháng khuẩn tốt đối với nhiều chủng vi khuẩn gram dương và gram âm, có tác dụng trên vết loét [4]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của lá trầu không, giải thích được tại sao cây trầu không được dân gian sử dụng trị vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, sâu kiến đốt, bỏng, viêm quanh răng, dùng điều trị bệnh viêm họng [7],... Mặt khác, kết quả nghiên cứu đã phát hiện ra khả năng trị được mầm bệnh thủy sản của lá trầu không, tương lai bào chế thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho gia súc và động vật thủy sinh từ lá trầu không [8]. Để khai thác lợi ích của chúng một cách tối ưu, các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học ở trong lá chè xanh và lá trầu không phục vụ lợi ích con người cần phải được nghiên cứu sâu hơn và hướng tới thương mại hóa sản phẩm ra thị trường. Vì vậy, “Nghiên cứu tách chiết Flavonoid từ lá chè xanh, trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn” được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp chiết tách Flavonoid phù hợp điều kiện Việt Nam và đánh giá tác dụng của nguyên liệu. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Hóa học và Kỹ thuật môi trường Đ. T. Huyền, L. M. Trí, N. T. T. Phương, “Nghiên cứu tách hoạt tính kháng khuẩn.” 286 2.1.1. Chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật chuẩn gồm chủng B. subtilis, E. coli, S. aureus, C. albicans do Phòng vi sinh vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học khoa học tự nhiên cung cấp. 2.1.2. Nguyên liệu thực vật Lá chè xanh và lá trầu không được rửa sạch, phơi khô, nghiền thành bột mịn. Cao chiết flavonoid được tách ra từ lá chè xanh và lá trầu không. 2.1.3. hương pháp nghiên cứu - Chiết tách flavonoid trong lá chè xanh, trầu không bằng dung môi được áp dụng ở Trung Quốc và trên thế giới. - Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên lớp mỏng Silica gel với các hệ dung môi toluen: ethylacetat: acetone: acid formic có tỷ lệ 5:2:2:1; Chỉ thị bằng UV/Vis 360nm; Thuốc hiện Von’s (Ce/NH4/MoO4)[5]. - Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp nối khối phổ (HPLC - MS) trên hệ thiết bị LC/MSD - Trap - SL. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn dựa vào phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Đầu tiên, các chủng vi sinh vật thử nghiệm được hoạt hóa trên môi trường đĩa thạch LB và YPG, ủ ở nhiệt độ 30C trong 5 ngày. Các khuẩn lạc thuần khiết được cấy sang bình tam giác chứa 20 ml môi trường LB và YPG, nuôi lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30C qua đêm. Sau đó, 100 µl dịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật sẽ được trải đều sang các đĩa thạch môi trường tương ứng, các đĩa sau đó được đục lỗ và bổ sung lần lượt các mẫu: dịch chiết từ lá chè xanh, dịch chiết từ lá trầu không, ethanol, nước cất khử trùng và kháng sinh zeocine (1%) với thể tích 80µl. Mẫu được ủ qua đêm ở 30C, sau đó lấy ra quan sát vòng kháng khuẩn của các mẫu và so sánh. . T U VÀ TH U N .1. Tách chiết hợp chất flavonoid từ lá chè xanh và lá trầu không Sau khi đã tối ưu được quy trình tách chiết lá chè xanh và lá trầu không để sản xuất hợp chất flavonoid từ các nguồn nguyên liệu trên với các thông số kỹ thuật như: dung môi chiết là ethanol và ethylacetate và dung môi n-hexan, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1, nhiệt độ 50C, trong 3 giờ, chúng tôi tiến hành tách chiết để thu hoạt chất flavonoid từ lá chè và lá trầu không. Hợp chất flavonoid được sắc ký lớp mỏng bằng bản sắc ký silica gel 60 F254 (Merck) với hệ dung môi toluen: ethylacetat: acetone: acid formic có tỷ lệ 5:2:2:1. A 1 2 3 B 4 5 6 Hình 1. Sắc ký đồ hợp chất flavonoid được tách ra từ lá chè xanh, lá trầu không (A) 1-3: Hợp chất flavonoid tách ra từ lá trầu không ở các mẻ khác nhau; (B) 4-6: Hợp chất flavonoid tách ra từ lá chè ở các mẻ khác nhau. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 287 Trên hình 1 sắc kí đồ dịch chiết lá chè xanh đều cho vết có băng đậm có Rf = 0,28 - 0,96 cm. Các vết thu được có màu sắc: màu xanh, màu vàng, màu nâu, màu nâu đậm. Các vết phân tách tốt, hàm lượng các vết tách biệt rõ ràng, riêng biệt, có màu nâu đậm cao, thể hiện băng rõ nét. Kết quả định lượng hợp chất flavonoid cho thấy, lá chè có chứa tới 10,34 % và ở lá trầu không đạt 9,2 % các hợp chất flavonoid (so với nguyên liệu khô ban đầu). 3.2. Định tính hợp chất flavonoid có trong dịch chiết lá chè xanh và trầu không bằng thuốc thử Bảng 1. Các phản ứng định tính của các hợp chất flavonoid thu được. HC flavonoid NaOH 10% FeCl3 5% Shinoda Diazo Vanillin Lá chè xanh vàng nâu 4+ xanh đen 4+ đỏ 4+ vàng cam 4+ vàng son 4+ Lá trầu không vàng nâu 2+ xanh đen 2+ đỏ 2+ vàng cam 2+ vàng son 2+ Ghi chú: Dấu +: Chỉ phản ứng dương tính; Các con số: Chỉ mức độ đậm nhạt của màu phản ứng. Phản ứng định tính đặc trưng của nhóm chất flavonoid được thể hiện ở bảng 1 cho thấy, các phản ứng định tính đặc trưng của nhóm chất flavonoid rất điển hình: Phản ứng FeCl3 cho màu xanh đen đặc trưng đã cho thấy sự có mặt của những flavonoid có cấu tạo orthodiphenol. Phản ứng shinoda có màu đỏ đậm đặc và phản ứng diazo có màu vàng cam điển hình chỉ ra sự có mặt các chất flavonoid mang nhóm cacbonyl (>C = 0) ở vị trí C4; đặc điểm cấu tạo hoá học này là một trong những yếu tố cơ bản cần có đối với một bioflavonoid (các chất flavonoid có hoạt tính sinh học). Phản ứng vanillin 1% có màu đỏ son đặc trưng cho thấy trong các mẫu lá chè này có chứa catechin và các dẫn xuất của catechin [1]. Qua các kết quả thu được cho thấy, tất cả các mẫu nghiên cứu đều giàu hợp chất flavonoid. Dựa trên các kết quả về định tính và phân tích sắc ký bằng TLC của hợp chất flavonoid từ lá chè xanh và lá trầu không, sử dụng cao chiết flavonoid này để làm nguyên liệu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất flavonoid. . . Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chất có hoạt tính sinh học tách từ chè xanh, trầu không 3.3.1. Đối với chủng vi sinh vật B. subtilis, E. Coli và Candida albicans Cao lá chè xanh và lá trầu không được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với các nồng độ 800, 400 và 200 mg/ml. Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiện qua đường kính kháng khuẩn tạo ra trên đĩa Petri, đường kính càng lớn hoạt tính kháng khẩn càng cao, vi khuẩn đó hoạt động càng kém. Kháng sinh được sử dụng để đối chứng là Zeocine (1mg/ml pha trong DMSO 5%), đối chứng âm là dung dịch nước cất vô trùng. A B Hình 2. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tách chiết được với với chủng vi sinh vật B: Subtilis (A); E. coli (B) (1: Dịch chiết từ lá trà xanh, 2: Dịch chiết từ lá trầu không, 3: Ethanol, 4: Nước cất, 5: Kháng sinh zeocine 1%). Hóa học và Kỹ thuật môi trường Đ. T. Huyền, L. M. Trí, N. T. T. Phương, “Nghiên cứu tách hoạt tính kháng khuẩn.” 288 Kết quả sau khi ủ 24 giờ, nhiệt độ 37ºC, ở mẫu đối chứng không có hoạt tính kháng khuẩn, các giếng còn lại đã xuất hiện vòng kháng khuẩn. Đối với chủng vi sinh vật: B. subtilis; E. coli, C. albicans với đường kính kháng khuẩn từ 0,5 cm đến 1,5 cm. Hợp chất flavonoid được tách chiết từ lá trầu không có vòng kháng khuẩn với tất cả các chủng vi sinh vật nghiên cứu, còn hoạt chất flavonoid từ lá trà xanh không có khả năng ức chế đối với chủng nấm men C. albicans. Kết quả cho thấy, mặc dù có khả năng ức chế với cả 3 chủng vi khuẩn còn lại nhưng vòng kháng khuẩn của hoạt chất flavonoid từ lá trầu không lớn hơn vòng kháng khuẩn từ lá chè xanh. 3.3.2. Đối với chủng S. aureus Đối với chủng S. aureus (chủng vi sinh vật gram dương - là chủng được quan tâm đặc biệt bởi nó là nhóm tụ cầu khuẩn nguy hiểm có khả năng gây nên quá trình viêm và sinh mủ ở người thì khả năng ức chế của mẫu chè xanh và lá trầu không thể hiện hoạt tính mạnh (hình 4). Hình 3. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tách chiết được đối với chủng C. albicans (1: Dịch chiết từ lá trà xanh, 2: Dịch chiết từ lá trầu không, 3: Ethanol, 4: Nước cất, 5: Kháng sinh zeocine 1%). Hình 4. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tách chiết được đối với chủng S. aureus (1: Flavonoid từ lá chè xanh, 2: Flavonoid từ lá trầu không, 3: Ethanol, 4: Nước cất, 5: Kháng sinh zeocine 1%). Từ những kết quả cho thấy, các hoạt chất flavonoid tách ra từ lá chè xanh và trầu không có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với 2 chủng E. coli và S. aureus. Hoạt chất flavonoid được tách chiết từ lá trầu không có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với hoạt chất tách ra từ lá trà xanh. Như vậy, hoạt chất flavonoid từ lá chè xanh và lá trầu không có khả năng ức chế các chủng sinh vi vật như C. albicans, B. subtilis, E. coli và S. aureus, đặc biệt là flavonoid từ lá trầu không với vòng kháng khuẩn lớn hơn so với flavonoid từ lá chè xanh đối với 4 dòng vi khuẩn kiểm định này. Từ đó mở ra hướng tạo sản phẩm từ sự kết hợp của hai loại nguyên liệu tự nhiên có hàm lượng các hợp chất flavonoid cao kết hợp với công nghệ nano tạo sản phẩm dung dịch khử mùi hôi chân phục vụ cho nhu cầu con người. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu công nghệ ngoài việc sử dụng các hoạt chất tự nhiên cần phải gắn các hoạt chất sinh học này vào các hạt nano để tạo ra một sản phẩm mới có chất lượng cao bằng công nghệ sinh học. Hướng công nghệ nano là một hướng được đề xuất trong nghiên cứu này. .4. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chất có hoạt tính sinh học tách từ chè xanh, trầu không khi chế tạo sang dạng nano. Hoạt chất Flavonoid tách ra từ lá trầu không và lá chè xanh được chuyển sang dạng kích thước nano theo các phương pháp chế tạo nano [3]. Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất này khi ở dạng nano. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Trong hình 5, hoạt tính được tăng lên nhiều sau khi chuyển dịch chiết sang dạng nano Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Viện Hóa học - Vật liệu, 9 - 2020 289 với đường kính kháng khuẩn là 3.1 cm. Kích thước nano xâm nhập thành tế bào, khả năng làm mất thông tin di truyền cũng như làm sai lệch thông tin là rất lớn. Đặc biệt khả năng thay đổi cấu trúc thành tế bào chính là nguyên nhân gây chết vi khuẩn. Hình 5. Hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết trước và sau quá trình chế tạo nano đối với chủng C. Albicans (1: Dịch chiết trước quá trình chế tạo nano, 2: Dịch chiết dạng nano, 3: Kháng sinh zeocine 1%.) Hình 6. Hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết trước và sau quá trình chế tạo nano (1: Hỗn hợp dịch chiết trước chế tạo nano, 2, 3: Dịch chiết từng loại, 4: Hỗn hợp dịch chiết dạng nano, đối chứng: Na-F) Sử dụng Na-F là một chất sát khuẩn thường có trong kem đánh răng làm chất đối chứng. Trên hình 3.6 ta thấy, hoạt tính của dịch chiết khi chuyển sang dạng nano vòng kháng khuẩn rộng. Sau khi hỗn hợp dịch chiết chuyển sang dạng nano hoạt tính tăng lên rất mạnh. Qua các thí nghiệm đối với các chủng vi sinh vật đặc trưng thấy rằng, hợp chất tách chiết từ chè xanh và trầu không được chuyển sang dạng nano có hoạt tính tăng lên rõ rệt, làm căn cứ cho các nghiên cứu tiếp theo. 4. T U N Đã tách chiết hợp chất flavonoid từ lá chè xanh và lá trầu không với các thông số kỹ thuật như: dung môi chiết là ethanol, ethylacetate và dung môi n-hexan, thời gian chiết 3 giờ, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 3:1, nhiệt độ 50C. Hoạt chất flavonoid tách ra từ lá chè xanh, lá trầu không đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là đối với 2 chủng E. coli và S. aureus với đường kính kháng khuẩn từ 0,5 cm đến 1,5 cm. Hoạt chất flavonoid được tách chiết từ lá trầu không có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với hoạt chất tách ra từ lá chè xanh. Hoạt tính kháng khuẩn được tăng lên rất nhiều sau khi chuyển dịch chiết sang dạng nano với đường kính kháng khuẩn từ 3,1 cm. TÀI I U TH M H [1]. Đỗ Thị Gấm, “Nghiên cứu một số đặc điểm hóa học và tác dụng sinh học của các chất thực vật thứ sinh trong cây chè Camellia sinensis”. Luận án tốt nghiệp thạc sĩ khoa sinh học, Trường Đại học KHTN, 2002. [2]. Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang, Đỗ Thị Gấm, “Đánh giá sự biến động thành phần polyphenol trong lá chè Tân cương (Thái nguyên) và hoạt tính chống oxy hóa của chúng”. Hội nghị Hóa sinh y dược 2014, tr 37-46. [3]. Công nghệ nano. Vi.wikipedia.org. [4]. Trần Chí Hải, Nguyễn Tấn Dân, Nguyễn Đình Nam, Lê Thị Hồng Ánh, Phan Văn Mẫn, “Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly polyphenol từ lá trà già”. Tạp chí KHCN ĐHĐN, 2016, 9(106), tr. 69-72. [5]. Bashir S et al. "Assessment of bioautography and spot screening of TLC of green tea (Camellia) plant extracts as antibacterial and antioxidant agents". Indian J Pharm Sci Hóa học và Kỹ thuật môi trường Đ. T. Huyền, L. M. Trí, N. T. T. Phương, “Nghiên cứu tách hoạt tính kháng khuẩn.” 290 2014, 76(4):364-370. [6]. Betts JW, Wareham DW, Haswell SJ, Kelly SM "Antifungal synergy of theaflavin and epicatechin combinations against Candida albicans". J Microbiol Biotechnol 2013, 23(9):1322-1326. [7]. Datta A, Ghoshdastidar S, Singh M "Antimicrobial property of Piper Betel leaf against clinical isolates of bacteria". International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR) 2011, 2(3):104-109. [8]. Barhe´, T.A., Tchouya, G.R.F. "Comparative study of the anti-oxidant activity of the total polyphenols extracted from Hibiscus Sabdariffa L., Glycine max L.Merr., yellow tea and red wine through reaction with DPPH free radicals". ArabianJournal of Chemistry, 2016, 9, pp. 1-8. ABSTRACT EXTRACTION OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM CAMELLIA SINENSIS AND PIPER BETEL LEAFS, WITH AN ASSESSMENT OF THEIR ANTIBACTERIAL EFFECTS In this article, flavonoid compounds from Camellia sinensis and Piper betel leaves were extracted and tested antibacterial activity on Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans and Staphycoccus aureus. The extraction process was performed under the following parameters: solvent solutions used are ethanol, ethyl acetate and n-Hexane, extraction time 3 hours, the ratio of solvent to material 3:1, the temperature 50 degrees Celcius. The results showed strong antibacterial effects of flavonoid, in particular on the two strains E. coli and S. aureus, with antibacterial diameters ranging from 0.5 cm to 1.5 cm. Flavonoid extracted from Piper betel leaves showed higher antibacterial effects than flavonoid from Camellia sinensis leaves. The antibacterial effect is greatly enhanced after transferring the extract into nano form exhibiting antibacterial diameters from 3.1 cm. Kewords: Bacillus subtilis; Candida albicans; Escherichia coli; Staphycoccus aureus; Antibacterial; Flavonoid. Nhận bài ngày 14 tháng 7 năm 2020 Hoàn thiện ngày 14 tháng 8 năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 24 tháng 8 năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Hóa học - Vật liệu/Viện KH-CN quân sự; 2Phòng Quản lý Khoa học Công nghệ/Viện KH-CN quân sự. *Email: doanhuyenhhvl@gmail.com.