Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật

Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật 1. Sự tạp nhiễm Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng như ve bét, môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy. - Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá, phát hoa hay rễ non. Tuy nhiên để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy…. của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. - Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác. - Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp:Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra. - Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm không thua gì nấm mốc, chúng có nhiều loài khác nhau: Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và Tyropharus putrescentiae… Ve bét có thể sống trong ống dẫn của máy điều hòa không khí, góc phòng, dưới kệ nuôi cấy. Nó hoạt động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những nơi có độ ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta thường không phát hiện nhiễm chúng, nhưng sau vài ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên bề mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường, đó là đường di chuyển của chúng. Ve bét xâm nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâm nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm và ve bét cùng lúc. Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết khi chúng xâm nhập sau khoảng 2 tuần. 2. Tính bất định về mặt di truyền Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen và Karp 1985; Fish và Karp 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng , số lượng và năng suất và biến dị này không di truyền. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị. 3.Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine. Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: - Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với nồng độ thường dùng 0.1-0.3%. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác. - Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau. - Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu: - Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non - Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng - Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy - Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần 4. Hiện tượng thủy tinh thể Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy. Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây. Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp. Nguyễn Văn Hiếu Tài liệu tham khảo: - Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học quốc gia TP. HCM - Edwin F. George (1993), Plant Propagation by Tissue Culture, part 1, Exegetics Ltd., Edington, Wilts. BA13 4QG, England. - Trần Văn Minh (1999), Giáo trình Công nghệ sinh học Thực vật, Viện sinh học nhiệt đới