Nuôi cấy mô – tế bào thực vật bằng tế bào trần và kĩ thuật chuyển gen

Chủ đề: NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT BẰNG TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT CHUYỂN GEN KHÁI NIỆM Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO TÍNH TOÀN NĂNG: Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hòa chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, do trong tế bào có chứa bộ AND(NST) hoàn chỉnh, chứa toàn bộ thông tin di truyền cho 1 chu kì sống hoàn chỉnh. AND mARN Protêin tính trạng Tùy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen). SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HÓA, PHẢN PHÂN HÓA CỦA TẾ BÀO: Phân hóa: 1 tế bào 1khối tế bào(phân hóa) mô cơ quan hệ cơ quan. Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu ki gặp điều kiện thuận lợi. Các đặc tính trên được xác định dựa trên cơ sở là đặc điểm di truyền nhưng sự thay đổi môi trường cũng có ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc tính đó. CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BỎ THÀNH CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT: Đảm bảo điều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm phải chuyên hóa cao. Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. CÁC BƯỚC TRONG KĨ THẬY NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất khử trùng cấy trong môi trường khởi động để tái sinh Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các chồi cho vào môi trường tạo rể (bố sung Auxin) mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh. Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rể) sẽ được chuyển sang môi trường tự nhiên. CÁC HÌNH THỨC NUÔI CẤY MÔ Nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô bằng tế bào trần NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Nuôi cấy mô của cơ quan tách rời: VD: củ cà rốt cắt lát tách mảnh mạch rây xử lí+ nuôi cấy mô phôi phôi nảy mầm cây non trong ống nghiệm cây trưởng thành Nuôi cấy từ mô hay cơ quan: VD: từ 1 mô lá tách tế bào nuôi cấy trên đĩa Pêtri điều kiện thuận lợi sẽ hình thành những cây non trồng chậu phát triển cây trưởng thành. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Từ 1 mô phân sinh của đỉnh sinh trưởng của rễ hoặc thân nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng sẽ tạo nên cây con Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn( Auxin rất quan trọng): Nuôi cấy bao phấn có hạt phấn chín môi trường thuận lợi bao phấn chín sẽ phân hóa bằng cách: nhân sinh sản sẽ tiêu biến nhân sinh dưỡng sẽ nguyên phân tạo mô sẹo nuôi dưỡng cây đơn bội(n) xử lí cônxixin cây trưởng thành(đơn bội kép). NUÔI CẤY MÔ BẰNG TẾ BÀO TRẦN Khái niệm tế bào trần: Là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lí enzim. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định hướng( vì không còn chịu sự tương quan trong hệ thống thực vật). SỰ CÔ LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN Sự cô lập: Trước hết phải xử lí vật liệu khởi đầu( lá, mô sẹo, dịch treo tế bào…) với enzim phân hủy vách( Xenlulaza, HemiXenlulaza, Pectolyaza…). Ví dụ: phương pháp tạo tế bào trần từ lá: Lá làm sạch lá bằng Clorox 10% rửa lại lá 3 lần bằng nước cất tiệt trùng tách lớp biểu bì dưới của lá+ gây co nguyên sinh 1h bằng Mannitol 10% enzim thu được tế bào trần. Sức trương tế bào bình thường thì được cân bằng với sức ép cơ học của vách vách mất, để tế bào không bị vỡ thì cho vào những chất gây co nguyên sinh (CaCl2,KCl,Mannitol…) hòa tan trong Enzim khi xử lí SỰ NUÔI CẤY Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vaät liệu thực vật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân cia đầu tiên Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa, mạch nha… Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu…. Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao, Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu. Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào. Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng nồng độ Auxin. Thông thường, tế bào trần cần 1-2 ngày cho sự hình thành vách, 2-7 ngày cho các lần nhân đôi đầu tiên, 3-4 tuần cho sự tăng trưởng mô sẹo, sau đó 1-2 tháng để có phôi hình cầu, 1tháng nữa để có cây nảy mầm. ÍCH LỢI CỦA TẾ BÀO TRẦN Tế bào trần có khả năng tái tạo vách và cho phôi thể hệ. Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi thể hệ từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi Xenluloz để xác định hướng kéo dài tế bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia. Thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật… Tế bào trần có thể chịu các xử lí gây đột biến và được dùng để tạo ra các dòng tế bào có nguồn gốc đơn bào. Tế bào trần thiết yếu cho sự lai thể hệ( dung hợp tế bào trần) và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…) MỞ RỘNG NUÔI CẤY MÔ BẰNG KĨ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT CHUYỂN GEN SỰ LAI THỂ HỆ BẰNG KĨ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Khái niệm: Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân tố bên ngoài. Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ. CÁC HÌNH THỨC DUNG HỢP Tự dung hợp: Vì màng sinh chất của tế bào(-) do nhóm P và Protein nên các tế bào trần đẩy nhau nên không tự dung hợp. Do đó phải làm các rế bào trần tiếp xúc nhau nhờ PEG hay sốc điện. Hóa dung hợp: Sự hóa dung hợp có thể thực hiện với NaNO3 0,25M, PVA 15 %…nhưng tần số dung hợp thấp nên ít được sử dụng. Virut Senday đã giảm hoạt tính là chất thường dùng hiện nay bằng cách cho giọt hỗn hợp 2 loại tế bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt PEG 25- 50% Điện dung hợp (tốtnhất): Khi đặt hỗn hợp 2 loại tế bào trần trong 1 điện trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc nhau và xếp thành 1 chuỗi dài dưới lực điện trường Sau đó dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt ở màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc. NHỮNG BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO Phần lớn tế bào lai có bộ NST không bền, nhất là từ cha mẹ xa nhau, 1 vài NST bị hủy bỏ sau 1 vài lần phân bào. Tính bền chỉ thấy được sau nhiều lần nhân đôi. Dung hợp tế bào trần có thể theo 2 kiểu: Dung hợp nhân 1 phần hay toàn phần: hình thành tế bào lai. 1 trong 2 nhân cha mẹ được giữ: tế bào chất lai Cả 2 đều mang gen trong tế bào chất. ÍCH LỢI VÀ TRỞ NGẠI CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN Ích lợi: giúp loại trừ tính bất thụ hửu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp; Không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh và trực tiếp. Trở ngại: Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện. Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp. SỰ CHUYỂN GEN TRONG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ CÁC KHÁI NIỆM VỀ KĨ THUẬT DI TRUYỀN Lai phân tử: Là sự dung hợp hai phân tử ADN có nguồn gốc khác nhau hình thành một phân tử ADN lai( ADN tái tổ hợp) hoặc hình thành một phân tử ADN lai gồm hai mạch: một mạch là chuỗi PolyNu, mạch đối xứng là chuỗi PolyRinu Coâng ngheä di truyeàn (öùng duïng cuûa kó thuaät di truyeàn) : Laø quy trình söû duïng kó thuaät di truyeàn ñeå saûn xuaát saûn phaåm sinh hoïc treân quy moâ coâng ngieäp ñeå ñaùp öùng nhu caàu cho con ngöôøi. Laø quaù trình coù tính toaùn ñeán saûn phaåm, giaù thaønh, kinh teá. Kĩ thuật di truyền: Là kĩ thuật thao tác trên vật liệu di truyền dựa trên những hiểu biết về cấu trúc của AxitNucleic và di truyền vi sinh vật. Sự truyền Gen: Là sự biến đổi bộ gen tế bào bởi sự xen vào đó 1 đoạn ADN ngoại lai sinh. ADN tái tổ hợp: Là phân tử ADN lai đạt được do sự kết hợp giữa 2 trình tự ADN của 2 loài khác nhau, hoặc cũng có thể được hình thành từ 1 mạch ARN và 1 mạch AND. Các Enzym công cụ: Enzym cắt(restriction Enzym): có khả năng nhận biết và cắt ADNsợi kép ở bhững vị trí rất chính xác. Ligaza: nối liền 2 đoạn ADN bắng cách tạo các mối liên kết P dieste liên kết các Nu. Reverse transcrip tase: cho phép sao chép ngược( tức sự tổng hợp cADN từ mARN. Véctơ truyền: Phân tử ADN nhỏ được dùng để ghép đoạn ADN cần nghiên cứu gọi là véctơ truyền. Thường dùng là Plasmid vi khuẩn hay ADN virut. Sự tạo dòng gen: Là quá trình cô lập và thu nhận nhiều bản sao giống nhau của 1 gen hay 1 đoạn gen dựa trên khả năng tự nhân đôi của ADN. Đây là cơ sở cho sự tăng bội đoạn ADN cần nghiên cứu. Sự sàng lọc và dò phân tử: Sự sàng lọc là quá trình tuyển chọn các Vectơ chứa đoạn ADN cần nghiên cứu. Sự tuyển chọn thực hiện nhờ lai phân tử kết hợp với 1 dò phân tử. Dò phân tử: Là các đoạn axit Nuclêôtit( ADN, ARN) sợi đơn: 20 đến vài trăm Nu; Người ta dùng để đánh dấu đoạn axit Nuclêôtit cần nghiên cứu trong 1 phản ứng gọi là’’ lai phân tử’’ nhờ được đánh dấu phóng xạ và có tính bổ sung và đối song với 1 vùng củ đoạn A.Nu cần nhận biết. SỰ CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP BỞI AGROBACTERIUM SỰ CHUYỂN GEN TRỰC TIẾP(BIẾN NẠP) Các phương pháp chuyển gen trực tiếp: hoá thẩm, điện thẩm, súng bắn ADN: Hoá thẩm: dùng PEG và dùng tế bào trần.(tần số chuyển gen thấp) Điện thẩm: dùng xung điện cao áp và tế bào trần. Cơ sở củ điện thẩm là khi tế bào chịu sự tác động của xung điện cao áp, các lổ nhỏ tạm thời được tạo thành trên màng trở nên thấm, ADN vào tế bào được theo khuynh hướng nồng độ. Tuy nhiên số lổ được tạo thành tăng theo điện thế cho tới 1 giá trị tới hạn( quá điểm này màng sẽ bị tổn thương không hoàn nghịch). Sự thành lập các lỗ nhỏ có thể do: Điện trường làm thay đổi cân bằng điện tích lớp P lipit màng Tính lỏng tạo nên những chổ yếu tạm thời dễ bị đứt dưới ảnh hưởng của điện trường. KĨ THUẬT BẮN ADN Các Plasmid có mang các gen lạ được cố đinh trên các hạt kim loại( vàng hay tungsten) có đường kính 0.000006m nhờ lực hút tĩnh điện. Các hạt kim loại- Plasmid này được bắn với vận tốc lớn để xuyên qua vách, màng và xen vào bộ gen nhân tế bào đích. Màng tế bào có 1 tính dẻo hoàn hảo nên dễ dàng sửa chữa sau khi bị tổn thương. Các phân tử ADN tách khỏi hạt kim loại sau khi vào nhân tế bào gia nhập vào ADN NST của tế bào. Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, ít công đoạn, hiệu quả kinh tế cao không chuyên biệt cho loài Không đòi hỏi cô lập và nuôi cấy tế bào trần. Dễ phát hiện các tế bào có mang gen được chuyển. Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền. Tần số chuyển gen thấp. Cả phương pháp gián tiếp và trực tiếp: sau khi tế bào thực vật đã mang gen đặc tính, chúng sẽ nguyên phân nhiều lần tạo ra1 khối tế bào phân hoá tạo mô cơ quan cây trưởng thành. Thaønh töïu – öùng duïng cuûa kó thuaät nuoâi caáy moâ baèng teá baøo traàn vaø kó thuaät chuyeån gen Baèng phöông phaùp dung hôïp teá baøo traàn vaø aùp duïng kó thuaät chuyeån gen caùc nhaø khoa hoïc ñaõ vöôït qua moïi raøo caûn sinh hoïc trong töï nhieân ñeå taïo caùc teá baøo lai vaø caùc gioáng thöïc vaät mang caùc gen mong muoán. Goùp phaàn quan troïng trong vieäc caûi tieán gioáng caây troàng, taêng naêng suaát. Taêng tính choáng chòu vôùi caùc ñieàu kieän khí haäu, thoå nhöôõng baát lôïi Taêng khaû naêng khaùng thuoác dieät coû Taêng khaû naêng choáng chòu vôùi caùc coân truøng vaø boï caùnh cöùng (baèng caùch chuyeån gen maõ hoaù toång hôïp thuoác tröø saâu trong caây thöïc vaät) Taêng khaû naêng phoøng tröø beänh caây Taêng naêng suaát caây troàng Taïo thöùc aên chöùa khaùng theå ñaëc hieäu cho gia suùc Tuy nhieân cuõng coù moät soá haïn cheá AÛnh höôûng söùc khoeû coäng ñoàng AÛnh höôûng moâi tröôøng sinh thaùi Aûnh höôûng kinh teá chính trò xaõ hoäi