PCR và ứng dụng trong y học

Dương Văn Tuân Phan Kiều Trang Nguyễn Anh Tuấn Phan Thị Lệ Thuý Phan Văn Tuấn Đặng Thị Hoàng Yến Đặng Xuân Viên Nguyễn Thị Thu Thuỷ Đào Thị Hồng Thu Nguyễn Thị Trang Bùi Thị Nguyên Trâm Hoàng Thị Thuỷ Tiên Đặt vấn đề          Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong đó có các nghiên cứu về các lĩnh vực y tế, khoa học đời sống. PCR là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy và tính đặc hiệu rất cao; do đó, PCR rất thích hợp cho xét nghiệm chẩn đoán trong lĩnh vực y học. I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR II. Nguyên lí hoạt động của PCR III. Một số ứng dụng của PCR trong y học Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích 1. Xác định quan hệ huyết thống 2. Xác định bệnh lao nhờ vsv 3. Xác định bệnh HIV, HBV, HCV, KST, Dengue virus 4. Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần , cơ cấu ký sinh trùng sốt rét I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.  Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì:- Giai đoạn biến tính (denaturation)- Giai đoạn bắt cặp (annealing)- Giai đoạn kéo dài (elongaction)         Chu kì này được lặp đi lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra các sản phẩm cuối cùng của PCR là các đoạn DNA hoặc RNA phiên bản. Số lượng các bản sao này được tính theo hàm số mũ. Máy PCR II.Nguyên lí hoạt động của PCR 1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix): - DNA khuôn - Taq. DNA polymerase. - d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). - Primer ( oligonucleotide). - PCR buffer. 2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles)  - Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ C Giai đoạn bắt cặp (annealing)45 thoi gian 20s-2phut Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 68-72 Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích Các bệnh phẩm y học Ly trích pre - nucleic acide Ly trích acide nucleic tinh khiết PCR ( RT - PCR) Phân tích phát hiện sản phẩm PCR bằng quang phổ hay điện di Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v... Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu điện, không cần bảo quản lạnh. Lấy mẫu đem phân tích 2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ. Tách chiết ADN 3. Nhân ADN đặc hiệu: Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước Nhân ADN đặc hiệu 4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid. Điện di 5. Nhuộm màu ADN: Chất lượng điện di và kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp được lựa chọn. Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp phần hạ giá thành chung Nhuộm màu ADN 6. Phân tích kết quả: Bản gel sau khi nhuộm xong sẽ có dạng như hình trên. Các đoạn ADN có độ dài khác nhau hiện rõ trên bản gel, có thể quan sát bằng mắt thường và đo đếm. Trong một số trường hợp, có thể xác định trình tự ADN để có kết luận cuối cùng. Hàng nghìn bản gel như thế đã được phân tích và hiện được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm. Phân tích kết quả III. Một số ứng dụng của PCR trong y học 1. Xách định quan hệ huyết thống Để xác đinh quan hệ huyết thống giữa hai người, có thể lấy ADN tách chiết từ những mẫu khác nhau như: máu tươi, máu khô, tế bào viêm mạc miệng... Có hai cách để lấy mẫu đem phân tích đó là: Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông  Xúc miệng bằng nước sôi để nguội cho thật sạch, khoảng mười lần. Lấy một que tăm bông trong phong bì có tên mình, không chạm tay vào đầu có bông. Há rộng miệng, đưa đầu bông vào phía trong má rồi chà xát đầu bông vào thành má lên xuống tối thiểu mười lần, vừa chà xát, vừa xoay tròn đầu tăm bông để toàn bộ các mặt của đầu tăm được thấm tế bào má. Lấy xong que thứ nhất, đưa trả lại ngay vào phong bì mà bạn vừa lấy ra. Lặp lại như thế với ba que tăm còn lại (nên nhớ là có bốn que thì hai que lấy tế bào má bên trái, hai que lấy tế bào má bên phải). Với trường hợp trẻ còn nhỏ, không tự lấy được thì người lớn lấy hộ Việc lấy mẫu máu khô sẽ do y tá thực hiện, theo tiến trình sau:  Chuẩn bị một miếng vải bông trắng sạch (mới), kích thước khoảng 3x3 cm. Viết tên người cho mẫu vào mép miếng vải trước khi lấy mẫu. Dùng cồn và bông lau sạch đầu ngón tay. Dùng kim chích máu chích vào đầu ngón tay. Nhỏ ba - bốn giọt máu thấm vào giữa miếng vải. Sau đó, phơi hoặc hong khô. Sau khi khô, mỗi mẫu được cho vào một túi ny-lông sạch, mới . 2. Xách định bệnh lao nhờ vsv . Phát hiện M. tuberculosis: Lao phổi: tốt nhất là đờm (được lấy vào buổi sáng sớm sau khi súc miệng thật sạch với nước muối sinh lý hay nước lọc, tránh lấy quá nhiều bọt). Lao ngoài phổi: lao màng não (dịch não tủy), lao màng phổi (dịch màng phổi), lao màng bụng (dịch màng bụng), lao xương/khớp (dịch hay mủ), lao đường tiết niệu (nước tiểu), lao hạch (chọc dịch hạch), lao màng tim (dịch màng tim). 3. Xách định bệnh HIV, HBV, HCV, KST, Dengue virus Máu bệnh nhân lúc đói Mẩu sinh thiết mô gan 2. Xử lí bệnh phẩm: Bệnh phẩm phải đựng trong biopure hay PCR tube Sau khi lấy để ngay ở nhiệt độ 40C hay - 200C Bệnh phẩm phải lấy đúng vị trí, đúng phương pháp và đúng thời gian 4. Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần , cơ cấu ký sinh trùng sốt rét Xác định chính xác từng loài KSTSR gây bệnh trên người là một khởi đầu quan trọng cho việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Một vấn đề mà kỹ thuật viên xét nghiệm KSTSR cần biết là P. faciparum kháng thuốc và sự biến đổi gen đã làm biến dạng hình thái các chủng loại KST SR . Hiện nay đối với sốt rét, ngoài phương pháp nhuộm giemsa phát hiện KST SRcòn có nhiều kỹ thuật mới đã và đang được áp dụng như : nhuộm Acridine Orange (AO), Paracheck, Para-sight F …và đặc biệt là kỹ thuật PCR. Cách lấy mẫu phân tích Tuỳ theo đối tượng nghiên cứu và ngẫu nhiên về giới tính, tuổi, nghề nghiệp, ….mẫu được lấy khác nhau. Thường thì mẫu được lấy máu đầu ngón tay nhỏ lên giấy thấm Whatman 3MM (thể tích máu 30-50l) để khô ở môi trường thực địa và cho vào các túi nhựa riêng biệt có đánh số thứ tự Phương pháp tiến hành *Vật liệu: -Hóa chất dùng để tách chiết DNA của hãng Sigma -Hoá chất dùng cho phản ứng PCR : + dATP , dTTP , dCTP , dGTP (Abgene) + Tag polymerase ( Abgene ) + Primer ( mồi ) : PLU5, PLU6 (Poligo ) , FAL,VIV, MAL, OVA (Sigma ) - Lam kính , thuốc nhuộm giêmsa - Giấy thấm Whatman 3MM Phương pháp được tiến hành qua 2 giai đoạn đó là: * Nested 1 : Phản ứng PCR để nhân bản gen đặc hiệu của Plasmodium. Mồi sử dụnglà Plu5, Plu6 Trình tự mồi : Plu55’-CCT GTT GTT GCC TTA AAC TTC -3’ Plu65’-TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG-3’ Điều kiện phản ứng :95 C – 5 phút(1 chu kỳ) 94oC – 1 phút 58oC – 2 phút 72oC – 2 phút(25 chu kỳ) 72oC – 8 phút(1 chu kỳ) * Nested 2 : Phản ứng PCR nhân bản gen đặc hiệu cho từng loài P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng loài . Thành phần phản ứng như Nested 1, chỉ khác DNA khuôn được lấy từ sản phẩm của Nested 1. Điều kiện phản ứng như Nested 1, chỉ khác từ bước 2 đến bước 4 được lặp lại 30 chu kỳ. Phương pháp phân tích kết quả: Sản phẩm PCR được phân tích kết quả bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose 2% có chứa ethidium bromide. Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu từng loài như bảng: