Phân tích microvesicles bằng kĩ thuật proteomics

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 7/2/2013 ‹#› ProteomicsGVHD: Th.s Lưu Thảo NguyênPHÂN TÍCH MICROVESICLES BẰNG KĨ THUẬT PROTEOMICS Nhóm thực hiện: Lớp: ĐHSH 6B Từ Như Phương 10284811 Bùi Thị Lệ 10057141 Nguyễn Thị Thùy Dung 10257781 Hà Thị Lý 10057121 Đinh Thị Mến 10055101 Võ Thị Hòa Đặng Thùy Mỵ Nguyễn Đăng Hùng 10058681 Ngô Kiến Phát 10058301 Võ Thị Cẩm Giang 10060401 Danh sách nhóm 6 Tổng quan Phương pháp Kết quả Thảo luận Microvesicles là gì? Microvesicles (đôi khi được gọi là exosomes) là những mảnh của màng tế bào khác nhau, sinh ra từ hầu như tất cả các loại tế bào. Microvesicles đóng một vai trò trong việc truyền thông tin nội bào và có thể vận chuyển mRNA và protein giữa các tế bào. Microvesicles đã có liên quan trong quá trình của một hiệu ứng đảo ngược chống khối u đáng chú ý trong ung thư, ức chế miễn dịch khối u, di căn, tương tác khối u chất nền và hình thành mạch cùng với việc có một vai trò chính trong việc tái tạo mô. Chúng bắt nguồn trực tiếp từ màng bào tương của các tế bào và mang thông tin kháng nguyên của tế bào. Chúng loại bỏ protein misfolded, chất độc tế bào và chuyển hóa chất thải ra khỏi tế bào. Tổng quan Thử nghiệm khả năng của tế bào gốc phôi người (hESC) và nuôi cấy bằng nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) để sản xuất MV. Chúng tôi đã tìm thấy rằng hESC tạo ra MV là nhiều nhất, trong khi phân bào MEF bị bất hoạt không sản xuất bất kỳ MV nào. Sử dụng phương pháp proteomics để xác định các phân tử tạo nên các thành phần chính của MV từ hESC được duy trì trong một môi trường tiêu chuẩn. => MV đại diện cho một cơ chế thông tin cho hESC, tuy nhiên, chúng cũng đóng vai trò như là chất mang tiềm năng của miễn dịch và hợp chất gây bệnh từ môi trường. PHƯƠNG PHÁP: 4 bước chính Môi trường nuôi cấy của hESC Phân lập MV có nguồn gốc từ hESC Phân lập MV có nguồn gốc từ tiểu cầu người Phân tích bằng proteomics Môi trường nuôi cấy của hESC Hai dòng hESC , ​​CCTL-12 và CCTL-14 được nuôi trên môi trường bất hoạt sự phân bào các tế bào trung chuyển từ chuột CF-1. Phân lập MV có nguồn gốc từ hESC Sau 1 số giai đoạn cụ thể ly tâm và tinh sạch, mẫu được lưu giữ trong PBS Phân lập MV có nguồn gốc từ tiểu cầu người Tiểu cầu của con người, được biết để sản xuất MV, đã được sử dụng song song để kiểm tra sự tách protocols MV. Nhuộm MV với chất kết nối màng PKH67 Phân tích bằng proteomics Sử dụng phương pháp điện di 2 chiều Mẫu được phân tích với song song MALDI-TOF và MALDI-TOF TOF phổ khối lượng. MALDI-TOF MS phân tích được thực hiện trên một Bruker Reflex IV. Hoạt động trong chế độ phản xạ tích cực. Phương pháp điện di 2 chiều: Dùng để phân tách hỗn hợp protein. Kết hợp giữa điện di theo điểm đẳng điện và điên di theo khổi lượng phân tử. Điện di theo điểm đẳng điện hay còn gọi là điện di tập trung đẳng điện (gradient pH). Trong dung dịch đệm có pH biến thiên liên tục, các protein sẽ phân ly đến vị trí tương thích với điểm đăng điện của mình. Điện di theo khối lượng phân tử phổ biến là SDS-PAGE, SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau, SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Khi cho dòng điện đi qua, phân tử protein đã được bọc SDS sẽ chuyển động trong điện trường từ cực (-) sang cực (+) và phân tách theo khối lượng Tự động hoàn toàn Autoflex TOF/TOF sử dụng thiết kế MALDI-TOF năng suất cao cho các ứng dụng trong sinh học công nghiệp. Autoflex TOF/TOF tích hợp công nghệ bản quyền Anchorchip của Bruker Daltonics để tạo mẫu đồng nhất và có vị trí chính xác. Phương pháp phổ khối lượng: MALDI :“Matrix-assisted laser desorption/ionization”, là kỹ thuật ion hóa bằng phương pháp khử hấp phụ laser hỗ trợ matrix. TOF :“Time-of-flight” là kỹ thuật phân tách các ion dựa trên thời gian bay. Autoflex kiểu TOF/TOF mới cho phép xác định protein với số lượng lớn bằng cách xác định khối lượng các peptit, sau đó là định danh protein sử dụng phép đo khối phổ kép MALDI-TOF/TOF. Thông tin đầy đủ về mẫu đo chỉ trong một khoảng thời gian cực ngắn (trong vòng vài giây). Kết quả: Sản xuất MV có nguồn gốc từ màng tế bào của hESC MV phân lập từ hESC được nuôi dưới điều kiện tiêu chuẩn trên một lớp feeder MEF sẽ không bị nhiễm MV từ MEF. Qua việc đo nồng độ protein trong MV mà có chứa phần nhỏ môi trường hESC được cô lập bằng ly tâm ở 40 000 đvị, chúng tôi xác định rằng 3.2390.32 mg / ml MV đã được giải phóng từ các tế bào này. Để giải quyết khả năng rằng sự phân lập của MV với độ ly tâm này là không đầy đủ, tăng mức độ ly tâm đến 100 000 đvị .Tuy nhiên, nồng độ protein của MV được phân lập với giao thức này là 3.2690mg / ml thì không khác biệt đáng kể so với nghiệm thức đầu tiên,cho thấy cường độ ly tâm thấp hơn là đủ để cô lập MV một cách thỏa đáng. Kiểm tra lại kết quả cho thấy: Khi trong môi trường không có tế bào ly tâm tại 100 000 đvị, thu được nồng độ của protein tổng số là 3.0290.31 mg /ml. Điều này chỉ ra rằng các mẫu đã bị ô nhiễm cao với các protein từ môi trường nuôi cấy, chứng tỏ rằng nồng độ của MV trong điều kiện môi trường hESC chỉ khoảng 0,2 mg / ml. Sau đó loại bỏ các protein gây ô nhiễmtừ môi trường bằng cách rửa với PBS. Trong các mẫu bị cô lập được ly tâm ở 40 000g hoặc 100 000 g được rửa hai lần với 10 ml dung dịch PBS, nồng độ protein tổng số là 0.290.1 ​​mg / ml (N010), chỉ ra rằng PBS rửa loại bỏ protein gây ô nhiễm và xác nhận các kết quả trước đây của chúng tôi. Phân tích Proteomics Hòa tan MV tách sang 2-DE. Điều này phân tích cho thấy phần lớn các protein có độ linh động đặc trưng của albumin. Điều này cho thấy protein có thể có nguồn gốc từ các tế bào nạp có liên quan chặt chẽ với các phần MV có nguồn gốc từ hESC. Số lượng  lớn albumin có thể can thiệp với 2-DE bằng tách ly protein, những điểm trên bản gel đã được tìm thấy để biểu diễn cho sự phân tán albumin. (A) khuẩn lạc của hESC nhuộm màu với PKH67 (màu xanh lá cây). Nhân tế bào được nhuộm với DAPI (màu xanh). Sự không đồng nhất, bảng nhuộm có vết lấm chấm chỉ ra rằng hESC có nguồn gốc khác thường có tác dụng ngăn sự hợp nhất của thuốc nhuộm với màng tế bào. (B) MV đầu tiên có nguồn gốc từ hESC được phân lập từ CM, được cố định trên kính hiển vi và dán nhãn với PKH67. Đường kính tối thiểu là 200 MV được đo và tìm thấy từ 150 đến 300 nm. (C) tiểu cầu nhuộm màu với PKH67 sau khi cảm ứng bởi một lượng canxi. Lưu ý sự kết hợp đồng nhất của chất nhuộm so với các cụm hESC. (D) MV đổ bởi tiểu cầu mà trước đây đã được nhuộm màu với PKH67. Hình vuông tại (B) và (D) cho thấy kiểm soát âm tính. Hình 1. hESC được tạo ra bởi MV rất nhiều. Hình 2. Ảnh dưới kính hiển vi (A) Một số hình của các MV có nguồn gốc từ hESC có kích thước 150-1200 nm. (B) Một số hình của các Mv có nguồn gốc từ hESC kích thước từ 50 đến 100 nm. Thanh 1000 nm (A) và 100 nm (B). Thank for your watching