Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước và thực phẩm

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM 1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM 1.1 Kế hoạch lấy mẫu Mật độ các vi sinh vật trong thực phẩm được qui địnhgiới hạn với một số lượng nhật định tuỳ theo từng nhóm vi sinh vật cần phân tích và yêu cầu của từng đối tượng thực phẩm cũng như các luật về vệ sinh an toàn thực phẩm. Đối với các vi sinh vật gây bệnh thông thường yêu cầu không được hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định. Số lựơng vi sinh vật được xác định trong thực phẩm có thể không bao giờ phản ánh chính xác số lượng vi sinh vật thực tế có trong mẫu, vì thế một khoảng giới hạn theo thông lệ được thiết lập để nhận biết các mẫu thực phẩm đạt hay không đạt yêu cầu vi sinh vật. Thông thường các khoảng giới hạn mật độ vi sinh vật trong thực phẩm được xác định bằng các khoảng như sau: Khoảng chấp nhận khi mật độ vi sinh vật nằm dưới một thông số chấp nhận (m), khoảng sát mép giới hạn khi mật độ vi sinh này lớn hơn giới hạn chấp nhận nhưng nhỏ hơn giới hạn trên (M). Khoảng không chấp nhận khi mật độ này cao hơn giới hạn trên M. Giới hạn M thường cao hơn ít nhất 10 lần so với thông số giới hạn m. Ví dụ tổng số vi sinh vật trong sản phẩm trứng được thanh trùng Pasteur có yêu cầu như sau: n = 5, c = 2, m = 5 x 104, M = 106 Trong đó n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được phép nằm trong khoảng sát mép giữa m và M. Kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm phân tích vi sinh vật gây bệnh. Theo kế hoạch này, số mẫu được lấy có thể 5,10, 20, 25 hay nhiều hơn để phân tích định tính nhằm phát hiện có hay không có sự hiện diện các vi sinh vật trong khối lượng mẫu thử nghiệm như trên. Sẽ không chấp nhận nếu có một trong số các mẫu trên có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh (n = 5,10,20 hay nhiều hơn, c = 0 và n = 0). Số lượng mẫu thử phụ thuộc vào mối nguy hiểm của từng loại thực phẩm nếu có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Thực phẩm có mối nguy hiểm cao là những loại thực phẩm không qua gia nhiệt trước khi sử dụng hay những thực phẩm có tính nhạy cảm cao, ví dụ thực phẩm dành cho người già và trẻ em … Lấy mẫu cho việc phân tích Salmonella: Số lượng đơn vị mẫu để phân tích Salmonella phụ thuộc vào các yếu tố đặc trưng của từng loại thực phẩm, có thể chia thành 3 nhóm thực phẩm chính như sau: - Nhóm thực phẩm dùng cho các đối tượng nhạy cảm với Salmonella nhưng không qua quá trình chế biến trước khi sử dụng, ví dụ thực phẩm dành cho người già, dành cho người bệnh hay dành cho trẻ em. Trong nhóm này số lượng đơn vị mẫu phải lấy khoảng 60 đơn vị mẫu. - Nhóm thực phẩm dành cho người trưởng thành. Số lượng đơn vị mẫu được lấy thường là 30 đơn vị. - Nhóm thực phẩm mà trong chế biến quá trình có qua giai đoạn có thể tiêu diệt Salmonella. Bước chế biến này có thể diển ra trong quá trình sản xuất hay chế biến tại gia đình. Trong nhóm này, số lượng mẫu được lấy thường là 15 đơn vị. Mỗi đơn vị mẫu được lấy ít nhất 100g, thông thường được lấy nguyên một đơn vị sản phẩm. Đơn vị mẫu được lấy ngãu nhiên sao cho mẫu đó đại diện cho cả lô sản phẩm. Trong trường hợp phải tách mẫu vào trong các vật dụng lấy mẫu phải luôn lấy một mẫu kiểm chứng để đảm bảo điểu kiện bảo quản mẫu tương tự với điều kiện khi lấy mẫu. Nếu một đơn vị sản phẩm không đủ khối lượng mẫu cần thiết, như trong trường hợp đơn vị sản phẩm được đóng gói nhỏ hơn 100g, khi đó mỗi đơn vị mẫu phải lấy nhiều hơn một đơn vị sản phẩm. Tại phòng thí nghiệm, các chuyên viên phân tích sẽ lấy đại diện 25g (hay khối lượng theo yêu cầu phân tích) từ các đơn vị mẫu để phân tích Salmonella. Trong trường hợp số đơn vị sản phẩm nhiều hơn số đơn vị mẫu, các đơn vị sản phẩm sẽ được tổ hợp một cách vô trùng và phân tích viên sẽ lấy đại diện khối lượng mẫu phân tích. 1.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản Giá trị của kết quả được phát hành bởi các phòng thí ngiệm phân tích phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp và qui trình lấy mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp cho từng trường hợp cụ thể để mẫu được mang vể phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng sản phẩm cần phân tích. Trong các nhà máy sản xuất, thông thường mẫu được lấy với một khối lượng nhỏ tại nhiều thời điểm và công đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất, không nên lấy một khối lượng lớn mẫu tại cùng một vị trí hay một công đoạn. Có thể tập trung lấy mẫu tại công đoạn thành phẩm nhiều hơn, nhưng trong một số trường hợp cần thiết có thể tập trung lấy mẫu tại một vài công đoạn trọng yếu trong quá trình sản xuất. Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu: Thường sử dụng các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, báo bao nylon để chứa mẫu. Không nên sử dụng các bình bằng thuỷ tinh để chứa mẫu bởi vì có thể bị vở gây nhiễm mẫu hay gây tại nạn cho người phân tích. Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại chất liệu khác khác nhau như vật dụng dùng để lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùng, hay các dao được rửa trong các dung dịch tẩy trùng. Không nên lấy vào các mảng băng. Sử dụng các thìa, kéo … để cho mẫu vào trong bình chứa. Đối với các thực phẩm đã đóng gói, lấy mẫu từ các gói lớn từ đó lấy ra các đơn vị bao gói nhỏ hơn. Mẫu phải được lấy ít nhất khoảng 100-250g cho mỗi mẫu tuỳ theo các yêu cầu phân tích, phải lấy tại nhiều vị trí trên sản phẩm hay trong cùng một công đoạn sao cho một khối lượng nhỏ mẫu cũng đại diện cho sản phẩm đó. Đối với các loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh chủ yếu là trên bể mặt, vì thế có thể sử dụng các dụng cụ lấy mẫu bể mặt để quét trên bể mặt sản phẩm hay cắt mẫu trên bể mặt với độ dày khoảng 2-3mm. Vận chuyễn và bảo quản mẫu: Các mẫu sau khi lấy được bảo quản một các độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông hay được phân tích ngay trong thời gian có thể. Nếu không thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở –20oC cho đến khi phân tích. Nếu các mẫu không thể bảo quản đông, thì phải bảo quản trong tủ lạnh 0-4oC không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm khó hư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. 1.3 Rã đông trước khi phân tích Phải sử dụng kỹ thuật rã đông trong điểu kiện vô trùng trước khi phân tích mẫu. Trong trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được rã đông trong các dụng cụ chứa như khi mang đến phòng kiểm nghiệm. Tránh các trường hợp chuyển mẫu sang các bình chứa thứ hai khi rã đông. Thông thường nhiệt độ rả đông là 2-5oC trong khoảng 18 giờ, nếu cần phải rã đông nhanh có thể thực hiện ở 45oC trong vòng 15 phút. Khi rã đông ỡ nhiệt độ cao, phải liên tục lắc bình chứa mẫu để tăng tốc độ rã và nhiệt độ của mẫu được đồng nhất. Đồng nhất mẫu Sự phân phối của các vi sinh vật trong mẫu không đồng đều nhau. Để đảm bảo tính đồng nhất trong các mẫu phân tích, các mẫu lỏng được lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đão trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng trong điều kiện vô trùng. Sau khi đảm bảo mẫu được đồng nhất, lấy một lượng mẫu xác định để phân tích tùy theo yêu cầu của từng chỉ tiêu cụ thể, ví dụ đối với các chỉ tiêu định lượng trong 1 gam, khối lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính như Salmonella khối lượng mẫu trích ra là 25 gam … Cân mẫu Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu như trên, cân chính xác khối lượng mẫu nhất định, sai số của phép cân này là ±0.1g. Lượng mẫu trích để phân tích được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. 2. LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC Tiêu chí của việc lấy mẫu là mẫu phải đại diện mức cao nhất của nước cần phân tích. Để đạt được mục đích này, người lấy mẫu cần phải tuân thủ các qui định và qui trình trong việc lấy mẫu và phân tích. 2.1 Dụng cụ chứa mẫu Các dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật là những chai lọ đã đã được súc rửa cẩn thận, tráng lại lần cuối cùng bằng nước cất và khử trùng trước khi sử dụng đế lấy mẩu. Có thể sử dụng các túi nhựa đã được khử trùng để làm dụng cụ chứa mẫu. Khử chlorin và độc tính kim loại trong mẫu nước Thêm một nhân tố có tính khử vào trong trong các chai lọ dùng đẩ chứa mẫu để khử chlorin hay các halogen khác. Trong trường hợp không có các tác nhân khử trong các lọ lấy mẫu, sau khi thu những mẫu nước có chứa chlorin các chai lọ lấy mẫu không được đóng nắp. Nhân tố khử thường được sử dụng đế khử chlorin trong nước là sodium thiosulphate, chất này trung hoà và khử các các haologen trong nước nhằm ngăn cản sự tác động của chúng lên các vi sinh vật trong mẫu trong thời gian vận chuyển. Sự loại bỏ các nhân tố tác động lên vi sinh vật trong quá trình vận vận chuyển và bảo quản mẫu để sau khi phân tích quả số lượng vi sinh vật phản ánh đúng mật độ của chúng ngay khi lấy mẫu. Hàm lượng sodium thiocianate được cho vào trong các lọ sao cho sau khi lấy mẫu chúng phòng thích vào trong nước với nồng độ 100mg/l. Trong chai lấy mẫu có thể tích 120ml thêm vào 0,1ml dung dịch Na2S2O3 10% sẽ trung hoà hết chlorin trong mẫu với nồng độ 15mg/l. đối với nước uống hàm lượng chất khử chlorin có thể sử dụng thấp hơn, khoảng 0,1ml dung dịch Na2S2O3 nồng độ 3% trong lọ chứa 120ml mẫu. Nồng độ chất khử này phóng thích vào trong mẫu nước là 18ml/l sẽ trung hoà nổng độ chlorin trong mẫu là 5ml/l. Trong trường hợp mẫu nước được khử trùng với hàm lượng chlorin cao, nồng độ các chất cho vào trong các lọ lấy mẫu phải đạt 100ml/l. Các tác nhân khử chlorin được cho vào trong các lọ lấy mẫu trước khi khử trùng. Có thể sử dụng phương pháp khử trùng ướt hay khử trùng khô đối với các dụng cụ lấy mẫu. Ngày nay có các túi lấy mẫu chứa sằn các tác nhân khử chlorin được bán tại các của hàng vật tư phòng thí nghiệm. Trong trường hợp mẫu nước chứa các kim loại như đồng, kẽm và các kim loại nặng … với hàm lượng cao hay nước thải, trong các dụng cụ lấy mẫu phải cho vào các tác nhân khử độc tính của các kim loại này. Tác nhân này đặc biệt cần thiết khi thời gian vận chuyển mẫu trên 4 giờ. Chất khử độc tính của kim loại nặng được sử dụng là muối sodium của EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) với hàm lượng phóng thích vào trong mẫu là 372ml/l. EDTA được điều chỉnh vể pH 6,5 trước khi dùng. EDTA cũng được cho vào trong các dụng cụ lấy mẫu trước khi khử trùng, hàm lượng cho vào là 0.3ml dung dịch EDTA 15% đối với chai lấy 120ml mẫu. Có thể kết hợp sodium thiocianat với EDTA trong cùng một dụng cụ lấy mẫu. Qui trình lấy mẫu Mẫu được lấy vào trong các dụng cụ lấy mẫu, không được lấy đầy chai mà mà phải chừa một khoảng không trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu được trộn đều bằng cách lắc trước khi phân tích. Mẫu được lấy phải đại diện cho nước được thử nghiệm, phải sử dụng các biện pháp vô trùng để tránh các trường hợp mẫu bị nhiễm từ bên ngoài hay nhiễm chéo giữa các mẫu với nhau. Trong quá trình lấy mẫu, giữ chặc chai cho đến khi nước đầy chai, giữ các nút hay nắp chai không được nhiễm trong khi lấy mẫu. Sau khi lấy đầy mẫu phải nút miệng chai ngay. Cách thực lấy mẫu được tiến hành như sau: - Lấy mẫu từ các nguồn là sông, suối, hồ chứa bằng cách cầm chai lấy mẩu trong tay, gần vị trí đáy chai, đưa cổ chai hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước. Xoay nhẹ để cổ chai hơi nghiên lên bề mặt nước và miệng chai hường về phía dòng chảy. Trong trường hợp không có dòng chảy như nước trong hồ hay trong các bồn chứa phải tạo ra một dòng chảy nhân tạo bằng cách xoay chai theo hướng nằm ngang và đẩy chai di chuyển về phía theo hương miệng chai. Trong trường hợp lấy mẫu khi đi trên thuyền, mẫu phải được lấy ở phía trước mũi thuyền. Nếu không thể lấy bằng cách thức này, có thể buộc một vật nặng vào bên dưới đáy chai rồi đưa từ từ vào trong nước. Trong mọi trường hợp đều tránh chai lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đáy của suối hai bồn chứa. - Có các dụng cụ đặc biệt cho phép mở nắp và lấy mẫu bên dưới mặt nước được sử dụng để lấy các mẫu nước sâu trong các hồ hay các bồn chứa. Có rất nhiều bình lất mẫu sâu hoạt động theo nhiều cách khác nhau như phổ biến nhất là bình lấy mẫu ZoBell-J-Z. Các dụng cụ lấy mẫu nước tự động theo yêu cầu ngày nay cũng đã được bán tại các của hàng vật tư phòng thí nghiệm. - Lấy mẫu nước sinh hoạt: Nếu lấy mẫu nước từ các vòi của hệ thống cấp nước dịch vụ, chọn những vòi cấp nước trực tiếp từ các đường ống chính, không nên lấy từ các thùng hay bồn chứa. Mở vòi nước thật lớn và để chảy ra ngoài từ 2-3 phút, trong thời gian này nhằm đề rửa sạch hệ thống vòi nước trước khi lấy mẫu, giảm vòi nước để lấy mẫu vào trong các bình chứa. Trong một số trường hợp cần phải làm sạch vòi trước khi lấy mẫu, dung dịch sodium hypochorite được cho chảy qua vòi trước khi lấy mẫu, sau khi khử trùng, phải mở nước vòi cho chảy khoàng 2-3 phút trước khi lấy mẫu vài chai. Không lấy mẫu từ các dòng nước chảy tràng bên ngoài vòi. Để ngăn ngừa các dòng nước chảy tràn từ bên ngoài vòi vào trong mẫu, có thể dùng dụng cụ phễu lọc để ngăn ngừa các dòng nước tràn từ bên ngoài vào trong bình chứa mẫu. Cũng có thể loại bỏ sự nhiễm từ bên ngoài do các dòng nước chảy tràn, cho nước nóng chảy qua vòi khoảng hai phút, làm lạnh từ 2-3 phút sau đó lấy mẫu vào bình. Nếu lấy mẫu nước từ các giếng bơm tay, bơm nước để rửa vòi giếng khoảng 5 phút trước khi lấy mẫu. Nếu giếng đào được trang bị máy bơm, cũng trực hiện tương tự như trên sau khi khời động máy. Trong trường hợp các giếng đào không có trang bị máy bơm, mẫu được lấy trực tiếp từ giếng bằng cách buộc chai lấy mẫu vào một vật nặng ở bên dưới đáy. Phải thật cẩn thận để tránh sự nhiễm bẩn từ vật nặng hay nước trên bề mặt giếng. Trong trường hợp lấy mẫu nước uống, phải lấy mẫu ở giai đoạn cuối của quá trình sản xuất, các vị trí phân phối mẫu nước uống phải được chọn lọc để đảm bảo sự tích lũy có hệ thống trong suối mỗi tháng. Phải xem xét thật kỹ càng vị trí của hệ thống phân bổ mẫu, ngay cả tại các điểm chiết để đảm bảo chất lượng vi sinh vật thông qua toàn bộ hệ thống để đảm bào rằng không có các vị trính nhiểm vi sinh vật hay nhiểm chéo do qua trình tiên tục của hệ thống như hiện tượng bể ống hay giảm áp lực trong qua trình khử trùng hay một nguyên nhân nào đó khác. Vị trí lấy mẫu có thể là vòi nước công cộng, các nơi kinh doanh ngành thực phẩm, nhà hàng hay giếng nước các nhân … Nhưng đặc biệt quan trọng khi lấy mẫu tại các mạng lưới cung cấp nước cho cộng đồng. Sự lấy mẫu, kế hoạch cũng như tầng suất và vị trí lấy mẫu phải được lên chương trình có sự tham vấn của các chuyên gia vệ sinh y tế công cộng, và ngành cấp nước. - Lấy mẫu tại các nguồn cấp nước: Mẫu được lấy trực tiếp từ các từ sông, suối, lạch, ao, các giếng hay các hồ chứa sao cho chúng đại diện cho nguồn nước cung cấp cho con người sử dụng. Mẫu không nên lấy quá gần bờ hay quá xa nơi đặt ống bơm nước, cũng không nên lấy mẫu quá sâu hay quá cạn so với vòi ống bơm. Mẫu được lấy càng gần miệng ống bơm, càng đại diện cho nguồn chất lượng của nguồn cấp nước. Kích cở mẫu: Thể tích mẫu phải đủ để đáp ứng các yêu cầu phân tích tại phòng thí nghiệm. Thể tích mẫu phải lấy không được nhỏ hơn 100ml. Mẫu sau khi lấy phải ghi đầy đủ và chính xác về ký hiệu, tên và các dữ liệu được mô tả. Không tiến hành phân tích các mẫu không đầy đủ các dữ liệu yêu cầu. Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu: Nếu có thể, phân tích các chỉ tiêu vi sinh ngay sau khi lấy mẫu để tránh những sự thay đổi không lường trước được. Nếu mẫu không thể phân tích ngay trong vòng 1 giờ sau khi lấy mẫu, phải bảo quản trong các thùng lạnh trước khi vận chuyển đến các phòng thí nghiệm. Nếu kết quả phân tích có liên quan đến pháp luật, phải sử dụng một phương tiện vận chuyển đặc biệt để chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian 6 giờ với một qui trình bảo quản đặc biệt. Nhiệt độ bảo quản nước uống, nước suối, hay nước bị ô nhiễm là dưới 10oC và thới gian vận chuyển không quá 6 giờ. Bảo quản trong tủ lạnh tại các phòng thí nghiệm cũng không dược quá 2 giờ. Trong điều kiện bắt buộc không thể vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm nhanh hơn 6 giờ, phải xem xét đến việc trang bị các phương tiện phân tích ngay tại vị trí lấy mẫu hoặt sử dụng qui trình ủ chờ. Tuy nhiên các yêu cầu như trên khó được đáp ứng. Trên thực tế các chỉ tiêu yêu cầu thới gian vận chuyển và bào qu ản không quá 24 giờ. Không chấp nhận các mẫu khi gởi đến phòng thí nghiệm bằng đường bưu điện và không được bảo quản theo các yêu cầu. Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu phải được lưu trữ đế sau khi phân tích dùng vào việc xử lý số liệu. 3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 3.1. Định nghĩa Vi sinh vật hiếu khí: là nhưng vi sinh vật phát triển để hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của ôxy phân tử. Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) là số khuẩn lạc xuất hiện trong môi trường nụôi cấy. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc cho phép ước đoán được số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 3. 2. Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc được hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như là chúng hình thành từ một tế bào đơn lẻ. Tuỳ theo các yêu cầu cụ thể trong việc phân tích, các đĩa môi trường sau khi cấy mẫu được ủ ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau. Theo yêu cầu của các tiêu chuẩn của nhiều quốc gia, chỉ tiêu này được ủ ở 30oC trong khoảng thời gian khoảng 3 ngày. Tuy nhiên một số yêu cầu khác có thể ủ ở nhiệt độ 20 - 22oC trong cùng thời gian trên. Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy để qui về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về khía cạnh vi sinh vật, qua đó đánh giá khả năng hư hỏng, cũng như thời hạn bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nước uống hay các sản phẩm khác. 3.3. Môi trườnng và vật liệu phân tích Môi trừơng Plate Count Agar có pH 7.0 ± 0.2. Môi trường được phân phối vào trong các bình thuỷ tinh hay trong các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Bảo quản ở trong tủ lạnh từ 2–8oC. Trước khi sử dụng môi trường phải được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt. Dung dịch pha loãng saline pepton water: gồm 8.5 gam NaCl và 1.0gam pepton. Dung dịch được phân phối vào trong các bình chứa 0.5-1.0 lít và phân phối vào trong các ống nghiệm với thể tích chính xác 9.0ml sau khi khử trùng 3.4 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích- Dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khữ trùng cân chính xác 10.0g mẫu vào trong bao PE. Tất cả các điều kiện làm việc và thao tác phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water. Sau khi đồng nhất nhận được dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-1.- Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu, thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5 phút. - Dịch mẫu ngay sau khi đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water , tránh tiếp xúc pipet với dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu trong ống nghiệm bằng máy lắc hoặc dùng pipet vô trùng khác hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 -10 lần. Dùng pipet đó chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống thứ hai chứa 9 ml dung dịch pha loãng. Tiếp tục như vậy sẽ có các dung dịch mẫu với các độ pha loãng 10-2; 10-3; 10-4; …cho đến khi có đủ các nồng độ pha loãng cần thiết. 3.5. Cấy mẫu Chọn hai hay ba độ pha loãng liên tiếp sao cho trong 1 ml chứa 25-250 tế bào vi sinh vật để cấy. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng. Mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 hay 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường Plate Count Agar đã được đun chảy và để ổn định ở 45oC.Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằn