Phương pháp PRC và các nguyên tắc thực hiện

Phương pháp PRC và các nguyên tắc thực hiện Phương pháp PCR - phản ứng dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA- polymerase - do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Khó khăn lớn nhất trước đây trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn. Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật. Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993. Thực chất đây là phương pháp tạo dòng invitro, không cần đến sự hiện diện của tế bào và dựa trên nguyên tắc được trình bày sau đây: Nguyên tắc của phương pháp PCR Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: - Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide. - Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu chỉ hướng đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung. - Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP. - Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNase. - Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl. Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhậy và nhanh. Ưu, nhược điểm và ứng dụng của phương pháp PCR Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời). Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết). Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase khoảng 104 (sai sót cho một lần sao chép). Phạm vi sử dụng - Sản xuất mẫu dò đánh dấu phóng xạ (dầu dò) với khối lượng lớn, phù hợp với phương pháp lai giữa DNA và DNA, RNA và DNA. - Khuếch đại số lượng RNA, do lượng mRNA nhỏ dưới mức cho phép nên người ta dùng phương pháp RT-PCR để tăng nồng độ mRNA đến một giới hạn phát hiện bằng cách phiên mã ngược: mRNA → cDNA. Từ cDNA, ta đánh giá được mRNA. - Khuếch đại DNA và RNA ngay tại hệ mô: Gọi là kỹ thuật insitu, kỹ thuật này được tiến hành ngay trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt cho lame. - Trong nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật PCR được dùng để nghiên cứu những thay đổi ở mức độ DNA của các dòng mô nuôi cấy và các cây tái sinh từ mô sẹo, để nghiên cứu sự có mặt của các gen ngoại lai trong các cây biến nạp. - Định lượng DNA: Khi nồng độ DNA thấp, dùng phương pháp PCR nhân lên đến mức xác định. Người ta xác định được số lượng bản mẫu ban đầu qua tính toán dựa vào sản phẩm cuối cùng và số chu kỳ nhân. Điều quan trọng là số chu kỳ nhân không được vượt quá giai đoạn đầu của phản ứng, khi mà số lượng bản sao còn tỷ lệ thuận với số lượng bản mẫu ban đầu. Ứng dụng: Trong pháp y, chuẩn đoán những bệnh di truyền, nghiên cứu mẫu khảo cổ, bảo tồn và duy trì những gen quí. Tách và thu nhận gen Ngày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba phương pháp: tách các đoạn DNA từ bộ gen; tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học; sinh tổng hợp từ mRNA. 1. Tách các đoạn DNA từ bộ gen Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn có kích thước 1,5 → 2kb bằng restriction enzyme (RE). Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết, sau đó gắn vào vector chuyển gen, tạo plasmid DNA tái tổ hợp. Nhược điểm là tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn sử dụng để tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries). 2. Sự tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học Năm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu Khorama, đó là gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) ở nấm men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì không có các trình tự điều hoà. Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotide. Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng hợp hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. và từ đó, nòi E. Coli mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta tổng hợp hóa học gen mã hóa hormone tăng trưởng của người dài 584pb. Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen insuline được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó, được nối lại nhờ enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và 286bp mã hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30 aminoaxit. Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp. 3. Sinh tổng hợp gen từ mRNA Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có mặt của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase). Sau đó, cDNA (complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA. Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA Ưu điểm là: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những trình tự không mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã hoá tổng hợp globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine (protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm. Vào năm 1992 các nhà khoa học Mỹ đã tạo được dòng cDNA của 2.375 gen của bộ não người. Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.