Phương pháp thu và xử lý mẫu

CHƯƠNG 1PHƯƠNG PHÁP THU VÀ XỬ LÝ MẪUGiỚI THIỆUMẫu phải có số lượng lớn và có tính đại diệnVị trí thu mẫu phù hợp với chủ đề nghiên cứuCó nhiều cách thu mẫuXử lý mẫu là một bước quan trọng trong phân tích1. Nguyên tắc trong thu mẫua. Định danh chính xác loài được thuMột trong những yếu tố quan trọng nhất trong nghiên cứu sinh học cá là phải xác định chính xác loài cá nghiên cứu. Loài được định danh thông qua các chỉ tiêu phân loại hình thái như hình dạng cơ thể, kiểu miệng, số lượng tia vi ngoài ra hiện nay người ta còn ứng dụng kĩ thuật phân tử để xác định loàiVí dụ:  Cá anh vũ Semilabeo notabilis Peters ,1880  Cá bám đá liền Sinogastromyzon tonkinensis Pellegrin et Chevey, 1935  Cá bống bớp Bostrichthys sinenesis Lacepede, 1802 Corica sp1 : Cá cơm sôngCorica sp2: Cá cơm sôngChitala ornata: Cá còmNotopterus notopterus: Cá thát látRasbora aurotaenia: Cá lòng tong đáR. lateristriata: Cá lòng tong đáR. sumatra: cá lòng tong đáLuciosoma bleekeri: cá lòng tong mươngHampala macrolepidota: cá ngựaHampala dispar: cá ngựaBarbonymus daruphani: cá mè vinhBarbonymus goninotus: cá mè vinhOsteochilus spiloleura: cá linh rìaLabiobarbus lineatus: cá linh rìaLabiobarbus siamensis: cá linh rìaBotia modesta: cá heoBotia lecontei: cá heoBotia hymenophysa: cá heoBotia eos: cá heoKryptopterus cryptopterus:cá trèn láKryptopterus sp: cá trèn láClarias macrocephalus: cá trê vàngLarias batrachus: cá trê trắngPangasius hypothalmus: cá traPangasius micronema: cá traPangasius bocourti: cá basaMystus rhegma: cá chốt sọcMystus vittatus: cá chốt sọcMystus wolffii: cá chốt trắngMystus gulio: cá chốt trắngHemibargrus planiceps:cá chốtArius cealatus: cá úc nghệArius venosus: cá úc nghệZenarchopterus ectunctio: Cá lìm kìmZenarchopterus clarus: cá lìm kìmZ.pappenheimi: cá lìm kìmDermogenys pusillus: cá lìm kìmStronggyluga strongyluga: cá nháiXenetodon canciloides: cá nháiDatniodes quadrifasciatus: cá hườngDatnioides microlepis: cá hườngBetta taeniata: cá lia thiaBetta splendens: cá lia thiaChanna striata: Cá lóc đen(cá quả)Channa micropeltes: cá lóc bôngPseudapocryptes lanceolatus: cá bống kèo vẩy nhỏParapocryptes serperaster: cá bống kèo vẩy toMacrognathus taeniagaster: chạch bôngMacrognathus circumcintus: ch5ch bôngSynaptura panoides: cá lưỡi mèoSynaptura sp: cá lưỡi mèoAuriglobus modestus: cá nóc vàngXenopterus naritus: cá nóc vàngChelonodon patoca: cá nócTetraodon fluviatilis: cá nócTetraodon sp: cá nócTetraodon cutcutia: cá nócb. Chọn địa điểm thu mẫuVị trí thu mẫu là yếu tố quyết định đến kết quả nghiên cứu. Tùy mục tiêu mà có vị trí thu mẫu khác nhau. Vị trí thu mẫu bằng cách đánh bắt trực tiếp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác định vùng phân bố, tập tính di cư, bãi đẻ, tập tính sinh sản.c. Bảng biểu thu mẫuTùy từng mục tiêu nghiên cứu mà có những biểu mẫu khác nhauĐối với những đề tài về nguồn lợi:Nơi khai thác Địa điểm thu mẫuLoại tàu khai thácNgư cụ khai thác5. Độ sâu ngư trường khai thác6. Diện tích khai thác7. Loài khai thác, tỉ lệ thành phần loàiĐối với những nghiên cứu về kinh tế xã hội nghề cá thì tùy từng đề tài mà có những biểu bảng khác nhauĐối với những nghiên cứu về dịch tễ học thì cần có những thông tin liên quan đến cách quản lí ao mùa vụ xuất hiện bệnh2. Thu mẫu phân tích ở phòng thí nghiệmKhái niệm quần thể:Quần thể là tập hợp gồm nhiều cá thể cùng loài, sống trong một khu vực địa lý nhất định, có cơ chế thích ứng chung đối với các điều kiện sống cụ thể và tạo thành một hệ thống di truyền hoàn chỉnh, có khả năng duy trì sự ổn định về cấu trúc của mình và có khả năng tham gia vào những biến đổi của quá trình tiến hóa. Đối với mẫu thu dùng trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm đòi hỏi phải đại diện cho quần thể nghiên cứu. Đối với những mẫu dùng trong nghiên cứu mô học đòi hỏi phải cố định trong những dung dịch bảo quản chuyên dụngNgoài ra đối với những mẫu thu trong nghiên cứu về tính ăn của cá thì phải thu vào lúc 5-7h Bên cạnh đó những mẫu thu phục vụ cho công tác nghiên cứu dinh dưỡng đòi hỏi phải cố định trong dung dịch chloran hydrate 10%, sau khi gây mê (nacortization) thì cố định ngay trong formol trung tính 40% và sau đó pha loãng 10% để bảo quản lâu dài.Có nhiều cách để thu mẫu, tuy nhiên có thể chia ra thành 2 phương pháp chính là:(i) thu mẫu ngẫu nhiên (ii) thu mẫu có chọn lọc Phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên chia làm 2 phương pháp thu hoàn toàn ngẫu nhiên thu ngẫu nhiên có giới hạn Đối với phương pháp thu ngẫu nhiên có giới hạn lại có 2 phương pháp thu: (i) thu mẫu phân tầng đối với quần thể không đồng nhất, (ii) thu mẫu nhiều giai đoạn, khi quần thể quá lớn thì tiến hành thu mẫu ở các quần thể đại diện và tiến hành thu mẫu từ những quần thể đại diện đó.Có nhiều ý kiến cho rằng số lượng mẫu nên dao động từ 1-25% kích cỡ quần thể. Số lượng từ 80-100 mẫu/tháng được cho là thích hợp cho nghiên cứu thông thường về sinh học cá3. Kĩ thuật bảo quản mẫuYêu cầu mẫu cho nghiên cứu sinh học phải còn tốt, những mẫu hư sẽ rất khó cho các phân tích vì thế mẫu cần được bảo quản càng nhanh càng tốt. Mẫu sau khi thu cần được rửa ngay bằng nước ngọt để mẫu thu được sạch đồng thời loại bỏ các vi sinh vật có thể bám theo mẫu, nhất là những mẫu thu từ ngư dân. Mẫu sau khi rửa sạch thì cần đánh dấu và cân trọng lượng, chiều dài cáMẫu thu có thể cố định trong formol. Mẫu dùng cho phân tích dạ dày cần phải được cố định ngay sau khi thu. Dung dịch cố định mẫu thường dùng là formol 10% cho những mẫu kích thước lớn (lớn hơn 15cm) và 5% cho mẫu có kích thước nhỏ. Dung dịch dùng cho cố định mẫu phải là dung dịch trung tính thường là borax được thêm vào formol với tỉ lệ 1: 1000Phần bụng của mẫu cá có kích thước lớn thì cần được mổ và cắt sâu vào trong cơ 2 bên thân cá. Những cá nhỏ hơn 15cm thì chỉ cần mổ phần bụng cá. Mẫu cá thường được cố định khoảng 7-10 ngày, sau đó rửa sạch và cố định lại trong dung dịch formol 10% hay cồn 700 nếu giữ trong cồn 700 thì nên giữ trong cồn 500 từ 5-7 ngày trước khi chuyển sang cồn 700. Trong trường hợp muốn giữ mẫu lâu, nếu dùng formol thì phải thay hàng tháng còn nếu giữ trong cồn thì 3 tháng/lần. Tuy nhiên tùy từng cơ quan mà cách bảo quản mẫu có thể khác nhau để phục vụ cho việc phân tích đạt kết quả tốt nhất.Vảy, đá tai, gai vi lưng hay gai vi ngực thường được sử dụng để xác định tuổi cá Vảy cá thường được thu từ 5-10 vảy cho mỗi cá thể. Thông thường vảy tròn được lấy ở vùng giữa vi lưng và đường bên, trong khi vảy lược được thu ở vùng vi ngực.. Trước khi thu vảy, mẫu cần được rửa sạch để loại bỏ các vảy dính trên thân cáNên chọn thu đủ số lượng mẫu với các vảy đồng dạng. Khi lấy vảy cần cẩn thận tránh làm tổn hại phần rìa của vảy. Mẫu vảy của mỗi cá thể có thể được chứa riêng trong các túi (giấy hay nilon) có dán nhãn với đầy đủ thông tin về mẫuMặt cắt thẳng đứng của đá tai cũng được sử dụng để xác định tuổi cá Cách thu đá tai dễ dàng nhất là thu qua một đường mở nằm trên đầu phía sau mắt, hoặc mở nắp hộp sọ.Một phương pháp khác để thu đá tai còn nguyên vẹn là lấy từ vòm miệng tuy nhiên phương pháp này khó thực hiện hơn PP bảo quản đá taiGiữ trong dung dịch glycerin và nước theo tỉ lệ 1:1Giữ trong dung dịch creosol hay terpineol (Gibson và Ezzi, 1978)Ngâm trong dung dịch 1% potassium hydroxide (strum, 1978)Gai cứng của vi lưng (hoặc vi ngực) cũng được sử dụng để xác định tuổi cá. Gai vi được cố định trong dung dịch formal-calcium ít nhất 24h. Cách chuẩn bị dung dịch này như sau:40% formol 10mlCalcium chloride khan 10gNước cất 80mlBột CaCO3 thêm vào quá mức bão hòaSau khi cố định, mẫu được rửa sạch bằng nước cất và chuyển vào dung dịch khử calcium trong thời gian từ 6-12h tùy thuộc vào chiều dài của vi. Dung dịch A gồm có 50g sodium citrate và 250ml nước cất. Dung dịch B gồm có 125 ml acid formic và 125 ml nước cấtCác phần khác của bộ xương như xương nắp mang, cột sống, xương gốc vi đuôicó thể thu được bằng cách đun mẫu trong nước sôi khoảng 5 phút.sau khi thu mẫu tinh sào cần phải đo chiều dài (tính bằng mm), cân trọng lượng và cho vào cố định trong cồn 700Buồng trứng sau khi thu cũng cần phải cân đo và xẻ dọc để cho dung dịch cố định thấm vào Để cố định trứng thì Simpson (1951) đề nghị dùng dung dịch Gilson’s fluid 100ml cồn 60%15ml acid citric 80%18ml acid glacial acetic20g mercuric chloride880ml nước cấtDung dịch này không những có tác dụng cố định trứng mà còn giúp phá vỡ các mô liên kết trong buồng trứng làm các trứng rời ra.Trứng đã được tách rời phải được rửa sạch bằng cồn tuyệt đối và sau đó bảo quản trong cồn tuyệt đốicho các phân tích về sau Ngoài ra việc bảo quản trứng còn có thể thực hiện trong dung dịch formol-saline theo đề nghị của Hancock(1979). Dung dịch này có thể chuẩn bị bằng cách pha 100ml formol 40% với 900ml nước cất và bổ sung thêm 100g NaCl. Buồng trứng trước khi cố định cần phải xẻ dọc để dung dịch thấm vào và buồng trứng cần được xáo trộn 2-3 tuần/lần trong vòng 5-6 tháng để trứng tách rời các mô liên kết. Dung dịch cố định phải thay định kì đến khi mẫu trứng được đem ra phân tích 4. Kĩ thuật cố định cho nghiên cứu mô họcĐây là kĩ thuật rất cần thiết cho các nghiên cứu mô học trên các cơ quan khác nhau của cá.Ống tiêu hóa và tuyến sinh dục là 2 cơ quan được nghiên cứu nhiều nhấtNgoài ra, mô còn được nghiên cứu trong lĩnh vực chẩn đoán bệnhMẫu thu cho các nghiên cứu mô học phải là mẫu tươi được lấy từ cá mới chết hay cá gây mê. Tùy loại mô và kích thước mẫu mà có các loại dung dịch cố định và thời gian cố định khác nhau Với các nghiên cứu về ống tiêu hóa, mẫu ống tiêu hóa của cá trưởng thành có thể được cố định bằng dung dịch bouin trong thời gian 12h sau đó chuyển sang bảo quản trong cồn 70%, với cá bột hay cá hương thì có thể cố định bằng dung dịch formol trung tính 10% Dung dịch Bouin được chuẩn bị như sauAcid picric bão hòa 750mlFormol 40% 250mlAcid acetic 50mlCách chuẩn bị dung dịch formol trung tínhNaH2PO4.H2O 4gNa2HPO4 6.5gNước cất 900mlFormol (37-40%) 100mlBên cạnh các dung dịch trên, thì AFA là dung dịch sử dụng trong cố định mẫu tômAFA gồm có:95% alcohol 330ml100% formol 220mlGlacial acetic acid 115mlTap water 335mlGAN – MÔ KHỎEGAN – MÔ BỆNHGan cá bệnh phù mắt do vi khuẩn A. sobria (H&E, 100x) a: sung huyếtb: vùng cấu trúc thay đổic: sung huyết tĩnh mạch trung tâmabc