Sản xuất protein trong y học (Phần 2)

CHƯƠNG 3 VECTORS  Vectơ là những phân tử DNA tái tổ hợp mà có thể được sử dụng để mang những đoạn DNA ngoại lai.  Các đoạn DNA được tạo dòng trong vectơ có thể đạt được với số lượng đủ lớn cho các thao tác trong phòng thí nghiệm.  Các vecto dựa vào trình tự DNA đã được sửa đổi và kết hợp để thực hiện những chức năng khác nhau.  Việc lựa chọn các vecto dựa vào kích thước phân tử DNA được chèn vào nó.  Các Vecto đã được khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơn DNA, sự biểu hiện cấp độ cao của các gen mã hóa protein, và việc sản xuất RNA. Phần lớn các thí nghiệm nhân dòng vô tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli cho nhân dòng DNA vô tính. Thậm chí nơi được đưa các đoạn DNA vô tính vào là tế bào eukaryote. Các cấu trúc DNA hầu như luôn luôn được sản xuất trong E.coli trước rồi sau đó mới đưa vào vật chủ cuối cùng. Việc nhân dòng vô tính có thể khả thi với những ưu điểm của E.coli nên nó được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật di truyền. E.coli, được đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) là vi khuẩn gram âm, hình que di chuyển bằng cách quay nhanh lông roi. Có nhiều trong miệng và ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi các vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêu hóa và sản xuất một lượng nhỏ vitamin B12 và K. Như là một sinh vật sử dụng trong phòng thí nghiệm, E.coli có những ưu điểm sau:

pdf168 trang | Chia sẻ: nguyenlinh90 | Lượt xem: 709 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Sản xuất protein trong y học (Phần 2), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Sản xuất protein trong y học 83 CHƯƠNG 3 VECTORS  Vectơ là những phân tử DNA tái tổ hợp mà có thể được sử dụng để mang những đoạn DNA ngoại lai.  Các đoạn DNA được tạo dòng trong vectơ có thể đạt được với số lượng đủ lớn cho các thao tác trong phòng thí nghiệm.  Các vecto dựa vào trình tự DNA đã được sửa đổi và kết hợp để thực hiện những chức năng khác nhau.  Việc lựa chọn các vecto dựa vào kích thước phân tử DNA được chèn vào nó.  Các Vecto đã được khai thác cho nhiều mục đích khác nhau: sản xuất sợi đơn DNA, sự biểu hiện cấp độ cao của các gen mã hóa protein, và việc sản xuất RNA. Phần lớn các thí nghiệm nhân dòng vô tính phân tử sử dụng vi khuẩn E coli cho nhân dòng DNA vô tính. Thậm chí nơi được đưa các đoạn DNA vô tính vào là tế bào eukaryote. Các cấu trúc DNA hầu như luôn luôn được sản xuất trong E.coli trước rồi sau đó mới đưa vào vật chủ cuối cùng. Việc nhân dòng vô tính có thể khả thi với những ưu điểm của E.coli nên nó được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật di truyền. E.coli, được đặt tên từ nhà vật lý học người Đức Theodor Escherich (1857–1911) là vi khuẩn gram âm, hình que di chuyển bằng cách quay nhanh lông roi. Có nhiều trong miệng và ruột người giúp bảo vệ vùng ruột khỏi các vi khuẩn truyền bệnh, giúp tiêu hóa và sản xuất một lượng nhỏ vitamin B12 và K. Như là một sinh vật sử dụng trong phòng thí nghiệm, E.coli có những ưu điểm sau: Dễ dàng tăng trưởng trong môi trường đơn giản, ít tốn kém. Là sinh vật có khả năng nhân đôi nhanh chóng khoảng 20-30 phút trong phase log. Bộ máy di truyền học của nó đã được hiểu rõ. Sử dụng E.coli trong phòng thí nghiệm thường an toàn và ngăn chặn đột biến là cho chúng không thoát ra được môi trường phòng thí nghiệm. Có một bộ gen đã được xắp sếp và lập chuỗi. Sản xuất protein trong y học 84 Các bản sao nhiễm sắc thể phụ của DNA (các Plasmid và thể thực khuẩn DNA) có thể được lợi dụng để mang các DNA ngoại lai. Các tế bào E.coli hầu hết là sinh sản vô tính nhưng để tăng tính đa dạng và tăng tính truyền đạt thông tin gen, chúng có các cơ cấu để chuyển các vật chất di truyền từ một vi khuẩn đến loài khác. Trở lại giữa thập niên 1940 các tế bào vi khuẩn được cho là có khả năng trao đổi vật chất di truyền với loài bán giới tính. Thí nghiệm của Lederberg and Tatum đã mô tả rõ ràng sự vận chuyển thông tin di truyền thông qua sự tiếp hợp vi khuẩn. Khả năng để thực hiện được sự vận chuyển này là từ một bộ gen được gọi là F. Những gen này tồn tại trong mảnh vòng của DNA mà được sao chép lại một cách độc lập từ nhiễm sắc thể vi khuẩn, hoặc chúng có thể được hợp nhất vào trong nhiễm sắc thể. Vi khuẩn mang những gen này ( thường là những vi khuẩn đực) dùng tua để bám vào một vi khuẩn gần nó, 2 tế bào được kéo lại gần nhau, và DNA được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia. Có 3 biểu hiển của nhân tố di truyền:  .F hay Fepisome là phân tử sợi đôi DNA tròn, lớn mà chỉ mang những gen di truyền, được giữ trong vi khuẩn như là một sợi nhiễm sắc thể phụ plasmid.  .Hfr: thành tố F đã được hợp nhất vào trong bộ gen E.coli. Khi sự tiếp hợp xảy ra, các gen F di chuyển qua tua kéo theo phần còn lại của gen sau chúng. Cuối cùng tua bị đứt, vì thế bộ gen không được chuyển hoàn toàn. Bộ gen vi khuẩn có thể được đo trong nhiều phút từ khi bắt đầu chuyển với một lược thời gian cần cho từng gen riêng biệt để được chuyển từ vi khuẩn này đến vi khuẩn kia cho biết được bao lâu kể từ khi bắt đầu sao chép.  .F’ : đây là phân tử sợi đôi DNA mang các gen di truyền và một số loại gen khác. Những gen này được vận chuyển với hiệu suất rất cao bởi vì độ dài của sợi DNA được chuyển khá ngắn đủ để nó có thể di chuyển dọc theo khúc nối giữa 2 tế bào vi khuẩn trước khi tua bị đứt. Khả năng của F’ episome để tái tổ hợp và được giữ như là một thực thể tách biệt với các nhiễm sắc thể vi khuẩn làm nó lý tưởng để mang các trình tự DNA ngoại lai. Tuy nhiên kích thước của F’ episome là ngăn cản sự phân tích và thao tác trên nó và thuộc tính gen chuyển của nó có thể làm cho không ổn định. Về tổng quan các DNA ngoại lai cần được mang trong vecto để bảo đảm sự truyền và tái tổ hợp trong tế bào vật chủ. Vecto được mô tả tốt nhất như là các trình tự DNA tự tái tổ hợp mà có thể được dùng để mang các DNA ngoại lai. Các vecto có nền tảng dựa trên các chuỗi DNA được tìm thấy có thể được tái tổ hợp dưới những hình thức khác nhau. Hầu hết các vecto được sử dụng dựa vào cả plasmid và thực khuẩn λ. Tổng quan, các vecto được xem như các môdun riêng biệt mà cung cấp các điều kiện cơ bản thiết yếu cho việc nhân dòng vô tính phân tử hiệu suất cao. Các vecto được sử dụng trong tái tổ hợp DNA thường được quy cho là các vecto dòng vô tính, trong khi nếu nó được sử dụng cho biểu hiện gen được mang trong DNA dòng vô tính, nó được gọi là vecto biểu hiện. Các vecto phải mang một trong các đặc điểm sau đây để làm cho nó trở nên hữu dụng trong nhân dòng vô tính phân tử: Sản xuất protein trong y học 85  Có khả năng tự sao chép  Có tính chọn lọc để nhận diện những tế bào đã biến đổi với những tế bào chưa biến đổi. Thêm vào đó hầu hết các vecto đều chứa những vùng enzyme nhận diện giới hạn để cho các đoạn DNA có thể được nhân dòng vô tính vào trong vecto một cách dễ dàng. Một mạng lưới lớn những loại vecto được sử dụng ngày nay, với các tính chất chuyên biệt cao và được thiết kế ra để thực hiện một chức năng đặc trưng. Trong chương này chúng ta sẽ bàn về một vài điểm tổng quan của việc thiết kế một vecto, nhưng sẽ tập trung vào các vecto dùng trong các thí nghiệm dòng vô tính. 3.1 PLASMID Plasmid thường được tìm thấy trong các đoạn DNA thuộc nhiễm sắc thể phụ mà thế hệ fromone được thừa hưởng ổn định từ một vùng nhiễm sắc thể phụ khác. Plasmid được phân tán rộng rãi trong prokaryote khoảng 1500bp đến hơn 300kbp. Hầu hết plasmid hiện diện như là các phân tử sợi đôi DNA vòng kín và thường có một kiểu hình riêng biệt trên tế bào vi khuẩn, nơi mà chúng được sao chép lại. Đó là vì plasmid thường mang gen mã hóa để chống lại các tác nhân kháng sinh và kim loại nặng, hoặc để sản xuất nguồn DNA hạn chế và các enzyme sửa chữa, những thứ mà vi khuẩn khi bình thường thì không có được. Sự sao chép plasmid thường được ghép đôi với tế bào chủ nơi mà chúng được giữ lại, cùng với sự sao chép plasmid là sự sao chép lại bộ gen của tế bào vật chủ. Plasmid thường được mô tả như dư dả (relaxed) hoặc khan hiếm (stringent) là dựa vào lượng bản sao của plasmid được giữ trong tế bào, plasmid dư tức nhiều bản sao được giữ lại trong một tế bào(10-200), trong khi plasmid khan hiếm khi chỉ hiện diện 1 hoặc 2 bản sao trong một tế bào.Nền tảng của sự khác nhau này là do cơ cấu khác nhau được thực hiện bởi plasmid để tự nhân đôi. Nói chung,plasmid dư thừa sử dụng vật chủ có nguồn gốc từ protein, trong khi plasmid khan hiếm mã hóa các nhân tố protein cần thiết cho sự nhân đôi của chúng. Hầu hết các plasmid được sử dụng ngày nay dựa trên nguồn gốc sự tự nhân đôi được tìm thấy trong plasmid E.coli ColE1 hoặc họ hàng gần của nó là pMB1. ColE1 là phân tử DNA vòng đóng dài 6646bp mã hóa cho tác nhân kháng sinh của vi khuẩn, Sản xuất protein trong y học 86 colicin E1 và các gen đề kháng mà giúp vi khuẩn vật chủ thoát khỏi ảnh hưởng của tác nhân kháng sinh. Colicin E1 là protein vận chuyển trên màng gây nên sự khử cực gây chết màng của vi khuẩn (Konisky và Tokuda, 1979). Gen kháng thuốc mã hóa cho protein ngăn cản hoạt động của Colicin bằng cách kiềm chế khả năng hình thành kênh xuyên màng vi khuẩn (Zhang và Cramer, 1993). Vi khuẩn có chứa pladmid ColE1 có thể khác biệt so với những vi khuẩn không chứa plasmid này bởi chúng có khả năng phát triển trong một dĩa có chứa colicin E1. Tuy nhiên việc bảo vệ cho quá trình phát triển này là khá khó khăn và đã lâu kể từ khi các kĩ thuật bảo vệ thuốc kháng sinh không còn được sử dụng nữa. Plasmid ColE1 được sao chép theo kiểu độc lập sử dụng DNA polymerase được cung cấp từ tế bào vật chủ. Không giống như nguồn gốc sao chép thuộc vi khuẩn, sự sao sao chép của ColE1 chỉ diễn ra theo một chiều. Plasmid không mã hóa cho protein khởi sướng quá trình sao chép nhưng lại mã hóa cho các phân tử RNA không dịch mã, các RNA này có liên quan đến sự khởi sướng quá trình sao chép cũng như một protein đóng vai trò điều hòa các phân tử RNA. Nguồn nhân đôi DNA của ColE1 là một vùng của DNA mà 2 phân tử RNA (RNAI và RNA II) được phiên mã từ nguồn khởi xướng của chúng (hình 3.2). RNA II được bổ sung vào gốc sao chép ColE1 và gắn vào nó hình thành nên dạng lai DNA-RNA (Cesarenivà cộng sự, 1991). Phân tử gắn RNA II được tách ra từ gốc, bởi enzyme mã hóa vật chủ RNase H và đáp ứng như một đoạn mồi nơi mà sự sao chép DNA xảy ra. Trong quá trình bắt cặp base, RNAII chỉ có thể gắn lên 1 sợi DNA, và kể từ đây sự sao chép DNA là đơn hướng. Hình 3.2: Plasmid ColE1 và gốc sao chép. Plasmid ColE1 là một sợi đôi DNA vòng kín, dài 6646bp. Nó mã hóa cho tác nhân kháng sinh trong vi khuẩn colicin E1 và protein miễn dịch giúp ngăn các ảnh hưởng từ chất độc trong các tác nhân kháng khuẩn có trong plasmid. Sự sao chép DNA chỉ xảy ra theo 1 hướng như được chỉ ra từ mũi tên ori. Hai phân tử RNA chưa phiên mã, gọi là RNAI và RNAII, và sản phẩm protein của gen rop điều khiển quá trình sao chép. Mũi tên trên các gen cho thấy chiều hướng phiên mã. Sản xuất protein trong y học 87 Điều khiển quá trình sao chép được thực hiện bởi một phân tử RNA chưa phiên mã khác. RNAI được bổ xung vào gốc 5’ của RNAII và dạng RNA kép giữa RNAI và RNAII không thể thực hiện như là một đoạn mồi cho sao chép. RNAI có tồn tại tương đối ngắn, do đó plasmid ColE1 được giữ ở mức 15-20 bản sao trong một tế bào. Sự tương tác giữa RNAI và RNAII được giữ ổn định bởi protein ROP(Helmer-Citterichvà cộng sự, 1988). Cơ cấu sao chép DNA thực hiện bởi ColE1 có một số vai trò quan trọng, 2 plasmid với cùng một gốc sao chép không thể cùng tồn tại trong một tế bào. RNAI của gốc plasmid ngăn cản RNAII của plasmid đi vào để khỏi hình thành đoạn mồi, đây không gọi là sao chép. Điều này quan trọng trong các thí nghiệm nhân dòng vô tính khi mà một tập hợp các plasmid được hòa trộn, điều mà tạo ra các phản ứng thắt nút, được chuyển vào trong vi khuẩn. Các cá thể chuyển theo phương pháp chỉ mang một plasmid đơn mà không phải là một tập hợp. Các Plasmid với các gốc sao chép khác nhau không thể cùng tồn tại trong một tế bào. MỘt hệ quả của cơ cấu sao chép ColE1 là sự tổng hợp DNA mới không cần khởi sướng sự sao chép DNA. Sự hiện diện các yếu tố kháng sinh mà ngăn cản sự tổng hợp protein, sự sao chép DNA nhiễm sắc thể bị ngừng lại nhưng với plasmid nền tảng ColE1 vẫn tiếp tục được sao chép và tích lũy với nồng độ cao (1000–2000 bản sao một tế bào) (Clewell, 1972). 3.1.1. pBR322 ColE1 và tương ứng với nó là pMB1, hữu dụng trong nhân dòng vô tính vecto nhưng chúng lại có một số bất lợi. Đầu tiên, khó khăn trong việc nhận diện plasmid tái tổ hợp làm chúng không được sử rộng rãi. Cần một plasmid có thể được sao chép giống với cách của ColE1, nhưng phải trong plasmid nào dễ nhận diện. Plasmid pBR322 lần đầu tiên được sử dụng như là một vecto plasmid, là một plasmid nhỏ (4363bp) được cấu thành từ các plasmid trong tự nhiên và các đoạn DNA khác (Bolivar và cộng sự, 1977). pBR322 mang những thành phần sau đây.  Gốc sao chép : pBR322 mang gốc sao chép ColE1 và gen rop để bảo đảm một lượng bản sao plasmid hợp lý ( 15-20 một tế bào) có thể tăng lên 200 vòng nhờ sự khuyếch đại chloramphenicol. Gen kháng kháng sinh: pBR322 mang 2 gen mà có thể được sử dụng như là các tín hiệu chọn lọc. Gen kháng ampicilin được nhân dòng vô tính vào trong plasmid nhờ Sản xuất protein trong y học 88 gen nhảy Tn3. Gen kháng tetracyline được nhân dòng vô tính từ plasmid pSC101 (Bernardi và Bernardi, 1984). Vùng nhân dòng vô tính: plasmid mang các vùng nhận diện enzyme giới hạn.một vài trong số này có trong cac gen kháng kháng sinh. Ví dụ như vùng cho PstI, PvuI và SacI được tìm thấy trong gen kháng ampicilin hoặc vùng cho amHI và HindIII trong gen kháng tetracylin. Các gen kháng kháng sinh trong pBR322 cho phép chọn lọc trực tiếp các chất tái tổ hợp trong một chu trình được gọi là bất hoạt vùng gắn (insertional inactivation). Ví dụ, nếu chúng ta muốn nhân dòng vô tính một đoạn DNA vào trong vùng BamHI của pBR322, sau đó DNA gắn sẽ làm ngắt quãng vai trò của gen KHÁNG chống tetracilin, nhưng vai trò của gen chống ampicilin vẫn không bị thay đổi. Các tế bào đã biến đổi được nuôi trên một đĩa thí nghiệm mang ampicilin để diệt hết tất cả các tế không mang plasmid. Sau đó được cho phát triển tiếp trên mội trường có cả ampicilin và tetracilin. Những tế bào có thể phát triển khi có ampicilin nhưng lại chết dưới sự chọn lọc của tetracilin sẽ mang plasmid có DNA gắn vào. Nói cách khác, sự thêm vào các đoạn DNA ngoại lai vào các gen kháng kháng sinh làm bất hoạt gen và dẫn tới tính nhạy cảm với yếu tố kháng sinh. Hình 3.4 Sự lồng vào yếu tố gây bất hoạt của gen kháng kháng sinh trong pBR322. Nếu đoạn DNA được lồng vào vùng nhận diện enzyme giới hạn BamHI bên trong gen tetracyline, gây ra bởi plasmid tái tổ hợp khi được chuyển vào trong vi khuẩn sẽ vẫn Sản xuất protein trong y học 89 đem lại sự sống trên môi trường chứa ampiciline nhưng sẽ không thể xúc tiến được sự phát triển trong môi trường chứa tetracilin. Gen kháng Tetracilin sẽ bất hoạt về mặt chức năng khi có mặt DNA gắn. 3.1.2 pUC plasmid PBR322 là một đột phá trong lĩnh vực sinh học phân tử như là một plasmid lần đầu tiên được sử dụng trong nhân dòng vô tính phân tử nhưng tiêu tốn thời gian và dể gặp lỗi. Vào 1982 một chuỗi plasmid được phát triển cho phép nhận diện tế bào mang DNA ngoại lai trong bước sàng lọc đơn là plasmid pUC (Vieira và Messing, 1982). Nó có 3 đặc tính quan trong khi so với pBR322  Lượng bản sao lớn – đột biến trong gốc sao chép sản xuất ra 500-600 bản sao của plasmid trong một tế bào mà không cần dùng tác nhân khuyếch đại chloroamphenicol.  Sàng lọc xanh- trắng – Sàng lọc theo kiểu này là một dạng đặc biệt của hoạt hóa vùng gắn.  Nhiều vùng nhân dòng vô tính. Đây là một loại DNA nhân tạo mà chứa trình tự của nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn. Nó được gắn vào một phần của vecto mã hóa β-galactosidase α-peptide theo chiều hướng để không ảnh hưởng đến chức năng và biểu hiện của nó. Tuy nhiên việc gắn DNA ngoại lai vào hầu như luôn luôn làm phá vỡ hoạt động của α-peptide. Do đó các cụm tái tổ hợp vẫn còn màu trắng trong khi cụm không tái tổ hợp lại chuyển xanh. Hình 3.5- pUC plasmid Ưu điểm của pUC plasmid so với pBR322 là đoạn DNA ngoại lai có thể được nhân dòng vào nhiều vùng nhận diện enzyme giới hạn khác nhau và các chất tái tổ hợp nhanh chóng được sàng lọc. Thêm vào đó gốc α-bổ trợ chỉ cần một gen nhỏ để mang trên plasmid. DNA mã hóa α-peptide trong chuỗi pUC trong các vecto thì nhỏ hơn 400bp. Nếu như toàn bộ khung đọc mở LacZ được cần đến, trên 3500bp sẽ được giữ lại trong những vecto này. Nói chung, sự ổn định của nhiều vecto plasmid giảm trong Sản xuất protein trong y học 90 khi chiều dài của chúng tăng. Kết quả trong giới hạn chiều dài DNA là có thể được nhân dòng vô tính vào trong một plasmid riêng biệt. Ví dụ, khả năng tế bào vi khuẩn vẫn còn plasmid pUC tái tổ hợp giảm mạnh khi kích thước của chúng đạt đến 15kbp. 3.2 Lựa chọn chỉ thị (Dấu chuẩn chọn lọc) Một đặc điểm cơ bản của các plasmid là chúng tạo điều kiện cho vector được dễ dàng phát hiện. Các plasmid như vậy được sử dụng thường xuyên như các vector trong thí nghiệm tạo dòng. Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên trong các vi khuẩn và trong một số nấm men. Việc lựa chọn đánh dấu thường phụ thuộc vào các tế bào vật chủ được chuyển. Một số dấu hiệu chỉ có chức năng với các sinh vật nhân sơ, trong khi những một số khác có một tác động rộng hơn. Một số dấu hiệu thường được sử dụng lựa chọn được liệt kê dưới đây, cùng với cơ chế hoạt động của chúng.  Ampicillin – gắn vào và ức chế một số enzym trong màng tế bào vi khuẩn có liên quan đến sự tổng hợp của các thành tế bào Gram âm. Do đó, tế bào không nhân bản trong trường hợp có sự hiện diện của ampicillin. Các gene kháng ampicillin (AMPR hoặc bla) mã hóa cho các enzyme β-lactamase được tổng vào khe quanh tế bào chất của vi khuẩn, nơi mà nó xúc tác thủy phân của vòng β-lactam của ampicillin. Do đó, các sản phẩm của gen AMPR làm mất hiệu lực chất kháng sinh. Theo thời gian ampicillin trong môi trường nuôi cấy trên đĩa petri có thể bị mất hiệu lực khá rõ bởi β-lactamase. Khi điều này xảy ra, sức ép chọn lọc để duy trì các plasmid sẽ không còn nữa và quần thể tế bào có thể phát sinh mà không có plasmid.  Tetracycline – kết hợp với một protein tiểu đơn vị 30S của ribosom để ức chế sự di chuyển ribosome dọc theo mRNA và do đó cản trở quá trình dịch mã tổng hợp protein. Các gen kháng tetracycline (TETR) được mã hóa bởi 399 amino acid ở bên ngoài màng liên quan đến protein của tế bào Gram âm và ngăn chặn các kháng sinh xâm nhập vào tế bào. Như vậy, gene kháng thuốc không làm mất hiệu lực của kháng sinh. Sức ép chọn lọc sẽ được duy trì trong suốt quá trình nuôi cấy tế bào để giữ cho các plasmid có chứa gene kháng thuốc.  Chloramphenicol – kết hợp với các tiểu đơn vị 50S ribosome để ức chế sự tổng hợp protein. Các chloroamphenicol acetyltransferase (CAT) được mã hóa bởi gen kháng chloramphenicol (CMR). Các protein CAT là bốn (tetrameric) bào thể protein, trong sự hiện diện của acetyl coenzyme A, xúc tác hình thành các chất dẫn xuất hydroxyl acetoxy của chloramphenicol nó không thể liên kết với các ribosome. Như với ampicillin, các sản phẩm gen CMR làm mất hiệu lực của chất kháng sinh.  Kanamycin và neomycin – kết hợp với các thành phần ribosome và hạn chế tổng hợp protein. Các protein được tổng hợp bởi mã hóa gene KANR được tổng hợp ở khe quanh tế bào chất và cản trở việc vận chuyển các chất kháng sinh vào trong tế bào. Giống như các gene kháng tetracycline, gene KANR không làm mất hiệu lực các chất kháng sinh.  Bleomycin và zeocin – các kháng sinh glycopeptide liên kết với DNA và ức chế DNA và sự tổng hợp RNA. Chúng tác động chống lại hầu hết các vi khuẩn (bao gồm cả E. Coli), vi sinh vật có nhân điển hình (ví dụ như nấm men), các tế bào thực vật và Sản xuất protein trong y học 91 tế bào động vật. Các gene Sh ble từ vi khuẩn Streptoalloteichus hindustanus mã hóa một protein nhỏ có đề kháng đối với zeocin bằng cách gắn vào các chất kháng sinh (Gatignol, Durand và Tiraby, 1988).  Hygromycin B - ức chế bằng cách can thiệp dịch chuyển vị ribosome. Kháng sinh tác động chống lại cả hai sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Các gen kháng (HYGR, mã hóa hygromycin-B-phosphotransferase) bất hoạt các kháng sinh bởi sự phosphoryl hóa. Mặc dù vectơ plasmid được sử dụng cực kỳ rộng rãi sử dụng trong nhiều ứng dụng của việc tạo dòng và đã được thiết kế với mục đích tạo ra nhiều chức năng hơn. Những chức năng trong số này sẽ được thảo luận trong chương sau của cuốn sách này, nhưng ở đây tôi sẽ liệt kê một số ví dụ để cung cấp cho người đọc một chức năng chính trong sự đa dạng của việc sử dụng plasmid.  Tách dòng - hầu hết các thao tác thực hiện trên DNA trong phòng thí nghiệm đều lựa chọn có mang plasmid. Dễ dàng thao tác sử dụng và lưu trữ của plasmid nên thường được sử dụng trong các thí nghiệm về DNA tái tổ hợp.  Vector con thoi - những plasmid không chỉ chứa toàn bộ thông tin gốc nhân bản và lựa chọn đánh dấu cho E. coli, những trình tự cũng có chức năng tương tự để duy trì truyền lại ở các tế bào vật chủ khác. Ví dụ, plasmid cho nhân bản và biểu hiện của gen ở nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa toàn bộ thông tin nhân bản và đánh dấu lựa chọn cho cả E. coli và nấm men. Hầu hết các các thao tác DNA sẽ được thực hiện bằng cách sử dụng E. coli là tế bào chủ trước khi chuyển thành DNA cuối cùng được tạo ra vào trong nấm men.  Tạo ra RNA - nhiều plasmid đã được thiết kế để nhân bản đoạn DNA ngoại và nó có thể phiên mã thành RNA. Như vậy plasmid bao gồm các vùng khởi động (promoter ) cho