Sản xuất thuốc bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

Sản xuất thuốc bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 1. Insulin Insulin là một protein được tuyến tụy tiết ra nhằm điều hòa lượng đường trong máu. Cơ thể thiếu hụt insulin trong máu sẽ làm rối loạn hầu hết các quá trình trao đổi chất ở cơ thể, dẫn đến tích tụ nhiều đường trong nước tiểu. Trong cơ thể, insulin được tổng hợp dưới dạng proinsulin gồm ba chuỗi polypeptide: A, B và C. Khi proinsulin chuyển thành insulin, chuỗi C được loại bỏ, hai chuỗi A và B nối với nhau bởi hai cầu disulfide (-S-S-). Để điều trị bệnh này người ta thường tiêm insulin cho người bệnh. Chế phẩm insulin này được tách chiết từ tuyến tụy của gia súc. Tuy nhiên, để có được 100 gram insulin người ta phải sử dụng tụy của 4.000-5.000 con bò. Vì vậy, giá thành của insulin trước đây là rất cao. Mặt khác, vì cấu tạo của insulin bò hơi khác với insulin người nên trong máu của bệnh nhân được điều trị bằng insulin bò bao giờ cũng xuất hiện kháng thể đối với insulin bò. Điều này gây ra một số hậu quả không mong muốn làm giảm một phần hoạt tính của insulin cũng như giảm thời gian tác động của thuốc. Boger (1978) lần đầu tiên sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp thông qua vi khuẩn E. coli đã thu nhận được một lượng lớn insulin. Cụ thể, người ta đã chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin của người sang cho E. coli. Vi khuẩn E. coli tái tổ hợp gen được nuôi cấy trong nồi lên men có dung tích 1.000 L, sau một thời gian ngắn có thể thu được 200 g insulin, tương đương với lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 con bò. Thành công này đã cho thấy gen của người có thể làm việc một cách hiệu quả trong genome của vi sinh vật. Hai sản phẩm thương mại của insulin (được sản xuất từ nấm men S. cerevisiae tái tổ hợp) hiện đang được sử dụng là: Actrapid và Novolog (NovoNordisk). 2. Interferon Interferon có bản chất protein, là yếu tố miễn dịch không đặc hiệu, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh do interferon có phổ tác dụng kháng virus rộng. Thông thường để thu nhận interferon, người ta phải tách chiết chúng từ huyết thanh của máu nên rất tốn kém. Bằng phương pháp công nghệ DNA tái tổ hợp tương tự như insulin, hiện nay người ta có thể thu nhận một lượng lớn interferon thông qua các cơ thể vi sinh vật đã được tái tổ hợp gen để phục vụ cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng như viêm gan B, viêm gan C, một số bệnh ung thư do virus... Gilbert (1980) đã đoạt giải thưởng Nobel nhờ thành công trong việc thu nhận interferon từ E. coli đã được tái tổ hợp gen mã hóa interferon. Đến năm 1981, Đại học Washington (Mỹ) đã thành công trong việc thu nhận interferon từ nấm men S. cerevisiae có hiệu suất cao gấp 10.000 lần so với tế bào E. coli tái tổ hợp. 3. Hormone 3.1. Hormone sinh trưởng người (human growth hormone-HGH) Thông thường, HGH của động vật có vú được sản xuất từ tuyến yên của các động vật non và trong suốt thời gian trước khi chúng trưởng thành. HGH có tác dụng tăng tốc độ sinh trưởng và kích thích cơ thể tăng khối lượng cơ. Ở người sau 30 tuổi, sản xuất hormone sinh trưởng sẽ dừng lại, nếu tiêm HGH sau độ tuổi này sẽ gây ra sự phát triển cơ bắp và lượng mỡ giảm xuống. Hormone sinh trưởng người là protein chứa khoảng 191 amino acid, thiếu nó cơ thể người sẽ bị lùn. Trước đây hormone phát triển được tách từ tuyến yên của người chết. Mỗi tử thi cho khoảng 4-6 mg HGH và muốn chữa khỏi cho một người lùn phải cần lượng HGH thu được từ 100-150 tử thi. Điều này cho thấy một trở ngại rất lớn khi chữa trị chứng lùn cho trẻ em. Hiện nay, HGH đã được sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp thông qua E. coli với một hiệu suất rất lớn (1 L dịch lên men của E. coli thu được HGH tương đương với lượng chất này thu được từ 60 tử thi). Đây là một trong những protein được sản xuất bằng công nghệ sinh học hiện đại sớm nhất. HGH tái tổ hợp khác với HGH bình thường bởi một amino acid, do E. coli không có khả năng loại bỏ gốc methionine khởi đầu mà nó thường bị loại sau khi dịch mã trong tế bào người. Insulin và hormone sinh trưởng người là các protein tương đối đơn giản vì không bị glycosyl hóa và biến đổi nhiều ở hậu dịch mã, nên có thể dùng E. coli (prokaryote) làm tế bào vật chủ để sản xuất chúng. Đối với những protein đòi hỏi quá trình glycosyl và biến đổi hậu dịch mã thì không thể sử dụng tế bào prokaryote làm tế bào vật chủ trong công nghệ DNA tái tổ hợp mà phải sử dụng các tế bào eukaryote như: nấm men, nấm mốc, thực vật hoặc động vật. 3.2. Somatostatin Đây là loại hormone đặc biệt, thường được tổng hợp trong não động vật và người với một hàm lượng vô cùng thấp. Somatostatin có vai trò điều hòa hormone sinh trưởng và insulin đi vào máu, kiểm tra sự tổng hợp hai loại hormone này. Quy trình sản xuất loại sản phẩm sinh học đặc biệt quý này cũng bao gồm các bước chủ yếu sau đây: + Phân lập gen mã hóa somatostatin hoặc tổng hợp trong ống nghiệm. + Tạo dòng gen somatostain bằng cách gắn gen này vào vector plasmid để chuyển gen vào E. coli. Mỗi mẻ nuôi cấy 7,5 L vi khuẩn E. coli này sẽ cho ra 5 mg somatostatin nguyên chất. Trước đây, muốn có khối lượng hormone này phải tiến hành cả năm trên nguyên liệu lấy từ nửa triệu não cừu. 4. Vaccine Trong sản xuất vaccine, cho đến thời gian gần đây, người ta vẫn sử dụng vaccine bất hoạt hoặc vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể người và vật nuôi. Những vaccine được sản xuất theo cách này có một vài hạn chế, chẳng hạn vaccine sống nhược độc có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể người và vật nuôi. Đến nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh dại và viêm gan B. Sản xuất vaccine kỹ thuật gen là một lĩnh vực phát triển mạnh hiện nay của công nghệ DNA tái tổ hợp. Đây là loại vaccine được bào chế từ vi khuẩn đã được chuyển gen mã hóa tổng hợp một protein kháng nguyên của một loại virus hay một loại vi khuẩn gây bệnh nào đó. Hiện nay, các loại vaccine kỹ thuật gen được sử dụng cho người bao gồm vaccine viêm gan B, vaccine dại kiểu mới, vaccine tả kiểu mới, vaccine sốt rét và vaccine bệnh phong. Virus viêm gan B có vỏ ngoài lypoprotein. Kháng nguyên bề mặt là protein chủ yếu của vỏ ngoài, được phát hiện trong máu người bị nhiễm. Người ta biến nạp gen tổng hợp kháng nguyên của virus viêm gan B vào vi khuẩn E. coli sau đó sản xuất sinh khối ở quy mô lớn các vi khuẩn E. coli mang gen tái tổ hợp này, biến E. coli thành nhà máy sản xuất kháng nguyên để làm vaccine. Một số sản phẩm thương mại của kháng nguyên bề mặt viêm gan B (được sản xuất từ nấm men S. cerevisiae tái tổ hợp) hiện đang được sử dụng là: Ambirix (GlaxoSmithKline), Comvax (Merck), HBVAXPRO (Aventis Pharma), Hexavac (Aventis Pasteur), Infanrix-Penta (GlaxoSmithKline), Pediarix (GlaxoSmithKline), Procomvax (Aventis Pasteur), Twinrix (GlaxoSmithKline). 5. Một số loại thuốc khác Hiện nay có gần 140 loại protein trị liệu đã được cho phép sử dụng ở Mỹ và châu Âu. Các protein trị liệu có thể được chia làm hai loại: 1) các protein không bị biến đổi hậu dịch mã, và 2) các protein cần quá trình hậu dịch mã (hầu hết là kiểu N-glycosylation9) để có chức năng sinh học đầy đủ. Các protein không có quá trình glycosyl hóa (glycosylation)10, ở hậu dịch mã, biểu hiện đặc hiệu hoặc trong vi khuẩn E. coli hoặc trong nấm men và hiện nay chúng chiếm khoảng 40% thị trường protein trị liệu. Tuy nhiên, một số trong chúng đã biểu hiện ở cả hai hệ thống, chẳng hạn như insulin tái tổ hợp được sản xuất cả trong E. coli (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA) lẫn trong nấm men (Novolog, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Đan Mạch). Sản xuất các protein tái tổ hợp thường đòi hỏi quá trình N- glycosylation ở trạng thái tự nhiên của chúng, trong hầu hết trường hợp chúng cần các vật chủ biểu hiện là động vật có vú (hệ thống có khả năng bắt chước glycosylation của người). Các vật chủ prokaryote như E. coli không glycosyl hóa protein được, và các hệ thống biểu hiện thuộc eukaryote bậc thấp như nấm men hoặc các tế bào côn trùng thường ít ổn định để thực hiện glycosylation của động vật có vú. Tuy nhiên, việc nuôi cấy các tế bào động vật có vú gặp nhiều khó khăn như: môi trường dinh dưỡng đắt tiền, thời gian nuôi cấy dài ngày, tế bào rất mẫn cảm với các lực trượt của hệ lên men... (xem chương 6). Do đó, các yêu cầu sinh trưởng cho vật chủ biểu hiện các chế phẩm sinh-dược không được cải thiện đã buộc các công ty phải quay lại với các hệ thống biểu hiện của nấm men và nấm sợi (eukaryote) do chúng có khả năng cung cấp hiệu suất protein cao (> 1 g/L) trong các quá trình lên men ngắn ngày, để có thể tăng quy mô sản xuất (lên tới 100 m3). Tất cả các protein trị liệu dựa trên cơ sở nấm men hiện nay được sản xuất trong loài nấm men S. cerevisiae (Bảng 5.3), nhưng các loài nấm men khác cũng đã được phát triển để sản xuất protein trị liệu. Nấm men Pichia pastoris trước đây được công ty Philips Petroleum (Bartlesville, OK, USA) sử dụng như là một hệ thống sản xuất protein đơn bào, nhưng sau đó đã được biến đổi di truyền để biểu hiện các protein ngoại lai. Hơn 120 protein tái tổ hợp đã được biểu hiện trong loại vật chủ này, khá nhiều trong số đó có nguồn gốc từ người và động vật có vú. Gần đây hơn, nấm men P. pastoris cũng được dùng để biểu hiện các protein trị liệu (đang được thử nghiệm lâm sàng). Công ty Genencor (Palo Alto, CA USA) trước đây đã sử dụng các nấm sợi Aspergillus niger và Trichoderma reesei cho sản xuất quy mô lớn các enzyme công nghiệp tái tổ hợp. Nhưng gần đây họ cũng đã cố gắng biểu hiện các protein trị liệu (ví dụ: các IgG hoàn chỉnh) ở A. niger. Kháng thể này được sản xuất với hàm lượng < 1 g/L, được lắp ráp chính xác và liên kết với kháng nguyên. Thành công tương tự với biểu hiện kháng thể nguyên vẹn cũng đã thu được ở P. pastoris, tuy nhiên hàm lượng khá thấp < 40 mg/L. Người ta cũng đã chứng minh kháng thể được sản xuất trong A. niger có tập tính dược động học (pharmacokinetic behavior) và hoạt tính ADCC11 tương tự với các kháng thể có nguồn gốc từ các tế bào động vật có vú. Công ty Berna Biotechnology (Bern, Switzerland) cũng đã phát triển phương pháp biểu hiện protein thích hợp dựa trên cơ sở nấm men methylotrophic Hansenula polymorpha, đây là loài đang được nghiên cứu để sản xuất các vaccine tái tổ hợp.