Tinh sạch protein: Phân tách protein bằng điện vi trên gel

Tinh sạch protein (tt) V. Phân tách protein bằng điện di trên gel Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di. V.1Điện di một chiều Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này, được đặt tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và các đại phân tử khác như DNA và RNA. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay bất kỳ phân tử nào) trong điện trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát (f) Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lực kéo của độ nhớt fv tăng lên do sự ma sát giữa phân tử đang chuyển động với môi trường. Lực ma sát phụ thuộc vào cả khối lượng, hình dạng của phân tử đang di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường. Với một khối cầu có bán kính là r, ta có Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. điện di được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng điện từ trên xuống. Gel polyacrylamide, được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì nó có tính trơ về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng. Điện di là một cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích thước, sẽ bị tác động một lực để di chuyển trong cùng một chất nền. Gel ở đây có thể xem tương đương với một hạt trong cột lọc gel. Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS- PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE. Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein. Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ có một băng ngày càng đậm. Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu. V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng điện Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có tính acid và số acid amin có tính base của chúng. Điểm đẳng điện của một protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại điểm pH này, tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z trong công thức (1) bằng 0. Mỗi một protein có một pI riêng; ví dụ như pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là 10.6, trong khi pI của albumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8. Giả định cho một hỗn hợp protein chạy trong điện trường trong một miếng gel với một khuynh độ pH, không có sự hiện diện của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp này. Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này. V.3 Điện di hai chiều Đây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS- PAGE với điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm gel SDS- polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Khả năng phân tách của phương pháp này được chứng minh khi hơn một ngàn protein của vi khuẩn E. coli có thể được phân tách trong một lần chạy điện di. Những protein được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau có thể phân tách được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của tính hiệu sẽ được xác định. Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là có rất nhiều protein được phân tách nhưng lại phân biệt rõ. Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổi. V.4 Đánh giá kết quả tinh sạch protein Sau mỗi bước tinh sạch, những thông số sau cần được ghi nhận để có thể đánh giá quá trình tinh sạch protein: - Protein tổng số: lượng protein có trong một phân đoạn. Thông số này tính bằng cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân đoạn đó. - Hoạt tính tổng: hoạt tính của enzyme trong phân đoạn đó. Thông số này được tính bằng cách nhân hoạt tính của enzyme có trong lượng mẫu được xét nghiệm với tổng thể tích của phân đoạn đó. - Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số. - Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%. - Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng, được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu. Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm. Thật vậy, với kỹ thuật SDS-PAGE, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng protein mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng . Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch phải dựa cả vào 2 thông số mức độ tinh sạch và yield. Một quá trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu (nhiều protein ngoài protein mục tiêu) và làm phức tạp việc giải thích thí nghiệm. VI. Xác định khối lượng của protein Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để phân tích trong hóa học hữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên, cho đến gần đây, khả năng bay hơi quá thấp của protein đã làm mất tác dụng của phép ghi phổ khối lượng trong việc nghiên cứu các phân tử này. Khó khăn này đã được khắc phục khi có những kỹ thuật chuyển protein và những đại phân tử khác thành dạng khí được đưa vào ứng dụng là matrix- assisted laser desorption-ionization (MALDI) và electrospray spectrometry. Ở đây tập trung vào kỹ thuật MALDI. Trong kỹ thuật này, những ion protein được phóng ra và sau đó được tăng tốc qua một điện trường. Những ion này sẽ di chuyển qua một đường ống dài được hút chân không (flight tube), ion nhỏ nhất sẽ di chuyển nhanh nhất và đến đầu đọc trước nhất. Vì vậy, dựa vào thời gian bay (time of flight - TOF) trong điện trường ta có thể biết khối lượng của protein (hay chính xác hơn là tỉ lệ giữa khối lượng với điện tích). Với một lượng nhỏ phân tử sinh học, dù nhỏ đến khoảng vài picomole đến vài femtomole, vẫn có thể phân tích được với cách này. Một máy phổ ghi khối lượng dạng MALDI-TOF dược dùng phân tích hỗn hợp insulin và β- lactoglobulin. kết quả khối lượng của 2 protein này lần lượt là 5733.9 và 18,364, so với kết quả tính toán la 5733.5 và 18,388. Thí nghiệm này cho thấy MALDI-TOF thật sự là một kỹ thuật chính xác để xác định khối lượng protein. Kỹ thuật này còn được ứng dụng trong việc xác định dựa vào khối lượng của peptide (peptide mass fingerprinting). kỹ thuật này đã mở rộng khả năng ứng dụng của điện di hai chiều. Mẫu cần nghiên cứu được chiết và phân ra một cách riêng biệt bằng các phương pháp hóa học hay enzyme học. Khối lượng của các phân đoạn protein được xác định bằng phương pháp khối phổ. Cuối cùng, khối lượng của peptide được so với những số liệu đã có được tính trên máy vi tính. Kỹ thuật này cho kết quả khá tốt. Ví dụ, trong số 150 protein của nấm men được phân tách bằng điện di 2 chiều, kỹ thuật này đã giúp xác định được 80% protein. VII. Siêu ly tâm Siêu ly tâm không chỉ là một phương pháp có thể phân tách một hỗn hợp thô các thành phần của tế bào mà còn rất hiệu quả trong việc phân tách và phân tích những phân tử sinh học. Với phương pháp này, chúng ta không chỉ xác định được khối lượng và tỉ trọng mà còn biết được cả hình dạng của một phân tử cũng như phân tích những tương tác giữa các phân tử. Để có được những điểm này, chúng ta cần một diễn tả một cách toán học là một phân tử bị tác động bởi lực ly tâm như thế nào. Dưới tác động của lực ly tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua một môi trường lỏng. Để biết được tốc độ di chuyển của phân tử ta cần phải tính hệ số lắng (s) theo công thức với m là khối lượng phân tử, v là thể tích từng phần (nghịch đảo của tỉ trọng phân tử), p là tỉ trọng của môi trường và f là hằng số lắng thường được biểu hiện là đơn vị Svedberg (S) bằng 10-3 s. Giá trị S càng nhỏ, phân tử di chuyển càng chậm. Vận tốc lắng của một phân tử phụ thuộc vào khối lượng của nó. Một phân tử có cùng hình dạng cũng như tỉ trọng với các phân tử khác nhưng nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn Hình dạng cũng ảnh hưởng đến vận tốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt. Hệ số ma sát của một phân tử cuộn lại thì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnh dù chúng có cùng khối lượng. Vì vậy, một phần tử dạng thẳng lắng chậm hơn những phân tử hình cầu dù chúng có cùng khối lượng. Một phân tử đặc di chuyển mau hơn một phân tử ít đặc hơn bởi vì nghịch đảo của lực đẩy đối với phân tử đặc nhỏ hơn. Vận tốc lắng còn phụ thuộc vào tỉ trọng của dung dịch (p). các phân tử lằng khi p 1 và không di chuyển khi p = 1. Một kỹ thuật tách protein dựa vào hệ số lắng khác nhau của các protein là kỹ thuật ly tâm phân đoạn. đầu tiên là tạo khuynh độ tỉ trọng trong một ống ly tâm bằng cách trộn 2 dung dịch có tỉ trọng khác nhau, một có tỉ trọng cao, một có tỉ trọng thấp. Ví dụ, hỗn hợp sucrose 20% và sucrose 5% có khuynh độ tỉ trọng từ 5% ở phía trên đến 20% ở đáy tube. một lượng nhỏ dung dịch hổn hợp protein được nạp vào phía trên của khuynh độ về tỉ trọng. khi máy quay, protein sẽ di chuyển theo khuynh độ và tách ra dựa trên hệ số lắng của chúng. thời gian và tốc độ ly tâm có được qua thực nghiệm. Ta tạo một lỗ ở đáy ống ly tâm để thu nhận các phân đoạn của protein. Khối lượng protein được xác định trực tiếp bằng trạng thái lắng cân bằng có nghĩa là mẫu được ly tâm ở vận tốc thấp đủ để sự lắng cân bằng với sự khuếch tán. kỹ thuật này xác định khối lượng protein rất chính xác và có thể sử dụng cho protein không qua biến tính vì vậy cấu trúc bậc bốn của protein vẫn được bảo tồn. Đây là điểm lợi thế của phương pháp này so với SDS-PAGE, chỉ định được khối lượng của protein khi đã bị biến tính. Với hai phương pháp này, SDS-PAGE cho ta biết khối lượng từng đơn phân, siêu ly tâm phân đoạn cho ta biết khối lượng của dạng đa phân, ta có thể kết hợp để biết có bao nhiêu đơn phân trong một protein đa phân.