Ứng dụng phương pháp phân tích công cụ

Ứng dụng phương pháp phân tích công cụ Phương pháp phân tích công cụ là phương pháp thuộc bộ môn của ngành hóa (Hóa phân tích) nghiên cứu về thành phần cấu tạo và hàm lượng các thành phần của những mẫu khảo sát. Hóa phân tích thường được chia thành Hóa phân tích định tính và Hóa phân tích định lượng nhưng cũng hay được chia thành Hóa phân tích vô cơ và Hóa phân tích hữu cơ. Các phương pháp của hóa phân tích có thể được chia thành hai loại: định tính và định lượng. Ngoài ra còn được phân loại thành các phương pháp hóa học và các phương pháp vật lý. Hóa phân tích thực chất là ngành phân tích đóng vai trò quan trọng trong khoa học, kỹ thuật, trong nghiên cứu khoa học; điều tra cơ bản để phát triển tiềm năng, khai thác tài nguyên khoáng sản; đánh giá chất lượng sản phẩm. Sắc kí là một họ các kĩ thuật hóa phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian, giống như các vận động viên chạy maratông. Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu." Trong kĩ thuật sắc kí, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng. Nhiều kĩ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua, như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate. Ta phân loại phương pháp sắc ký như sau: Sắc ký: - Sắc ký khí: + Sắc ký khí lỏng (GLC) + Sắc ký khí rắn (GSC) - Sắc ký lỏng: + Sắc ký lỏng-lỏng (LLC) + Sắc ký lỏng-rắn (LSC) + Sắc ký trao đổi ion (IEC) + Sắc ký loại trừ (EC) Trong các phương pháp sắc ký thì phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện nay là phương pháp hiện đại và hiệu quả hơn cả do đó chúng ta tìm hiểu và ứng dụng nó trong thực tế. Nguyên tắc hệ thống máy HPLC: O 1 2 3 4 5 O: Nguồn cung cấp pha động (mobile phase) - Bình chứa pha động 1: Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi) - Bơm pha động vào cột tách - Điều khiển tốc độ động, áp suất củapha động 2. Van bơm mẫu (Injection valve): - Bơm mẫu PT vao cột tach theo những lượng mẫu nhất định Tiêm mẫu bằng tay Tiem mẫu tự động 3: Cột tach (Column) - Cột chứa pha tĩnh - Yếu tố quyết định qua trinh tach sắc ky - Cột tách có kích cỡkhác nhau - Chiều dài: 10 – 25cm - Đường kinh: 2 – 5mm 4: Đầu do (detector) - Thiết bị phat hiện chất phân tích (định tính và định lượng) - Co nhiều loại khac nhau tuy mục đích phân tích: UVVIS, Huỳnh quang.... 5. Hệ thống ghi nhân và xử lý tín hiệu: - Thu thập và xử lý kết quả - Recorder, Computer + printer, software Hệ thống HPLC Detector ♣ UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử Xác định các chất có khả năng hấp thụ quang ♣ Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác định các chất có khả năng phát huỳnh quang - Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu họ Carbamate,…. ♣ Đầu đo chỉ số khúc xạ ( Refractive Index Detector: RI) ♣ Đầu do độ dẫn (Conductivity detector): Xac định cac ion vô cơ, hữu cơ ♣ Đầu do khối phổ (MS: mass spectrometry) Xac định phần lớn các chất hữu cơ 3. Cac quá trình tách trong sắc ký lỏng - Qua trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký - Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký - Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất PT từ đầu cột đến cuối cột - Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đo pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định hoặc gradient - Hiệu quả của qua trinh tach phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh va pha động - Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp Thờigian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) quyết định bởi: Bản chất của pha tĩnh, cấu truc va tinhchất của chất PT Bản chất va thanh phần của pha động dung để rửa giải chất PT ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh) Ghi lại tòan bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất PT sắc ký đồ gồm nhiều peak. - Đặc điểm của peak PT: Các peak co thể tách rời nhau hòan tòan Chập nhau một phần Chập nhau hòan tòan - Sắc ký phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay không tốt. - Tách tốt: hỗn hợp có bao nhiêu chất có bấy nhieu peak riêng biệt không chập nhau - Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kem sẽ ra trước 4. Ưu điểm của phương pháp sắc ký - Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất - Không cần làm bay hơi mẫu - Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột - Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu do - Thể tich mẫu phân tích nhỏ (1-100mL) Ví dụ : XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TỪ LÁ, VỎ QUẢ MĂNG CỤT BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP TÓM TẮT Axit hữu cơ trong lá, vỏ quả măng cụt khô được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Lá tươi và vỏ quả măng cụt khô được chiết với nước ở nhiệt độ 127 0C thời gian 30-60 phút dưới áp suất 0,15 MPa. Đồng thời, vỏ quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol) trong bộ chiết soxhlet ở nhiệt độ 75 0C trong thời gian 8 giờ. Mẫu được bơm vào máy sắc kí lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút sử dụng đetectơ 210 nm. Axit hữu cơ chủ yếu trong lá, vỏ quả măng cụt khô được tìm thấy là axit (-) hyđroxy xitric hàm lượng lần lượt là 2,863 và 15,221 %. Phần axit còn lại trong lá, vỏ quả măng cụt là lượng nhỏ axit xitric. Đây là kết quả đầu tiên xác định thành phần các axit hữu cơ từ măng cụt (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.). 1. Mở đầu Trong một vài năm gần đây, các cấu tử có khối lượng nhỏ và phức tạp được chiết từ nhiều loài măng cụt (Garcinia Cowa, Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia antroViridis) trong đó có axit (-)-hyđroxy xitric (HCA; 1,2-di hydroxy propan-1,2,3 tri cacboxylic axit; hình 1), lacton của (-) axit hydroxy citric (hình 1)) có tính sinh học lý thú đã gây chú ý đối với các nhà hoá sinh các bác sỹ chuyên khoa sức khoẻ. Đó là khả năng điều chỉnh quá trình tổng hợp axit béo, sự hình thành lipit, sự ngon miệng, và giảm cân. Đồng phân của (-)-HCA đã góp phần lớn trong lĩnh vực dược học như tác nhân có vai trò quan trọng trong mục đích giảm cân, bảo vệ tim mạch, hiệu chỉnh trạng thái bất bình thường của các lipid, và khả năng chịu đựng trong luyện tập thể thao [3] [4] [5] [6]. Vỏ quả bứa có tính săn da và hơi đắng, mát, hơi độc, có tác dụng tiêu viêm, hạ nhiệt, làm săn da, hàn vết thương; trị: Loét dạ dày, loét tá tràng; Viêm dạ dày ruột, kém tiêu hoá; Viêm miệng, bệnh cặn răng; Ho ra máu. Dùng ngoài trị bỏng, mụn nhọt, sâu quảng, eczema, dị ứng mẩn ngứa, rút các vết đạn đâm vào thịt; Lá bứa có vị chua thường được dùng thái nhỏ nấu canh chua; Hạt có áo hạt chua, ăn được, cũng dùng nấu canh chua. Nhựa bứa dùng trị bỏng [1]. Các nghiên cứu chiết tách nguồn HCA chỉ thực hiện trên các loài bứa của Ấn Độ. Vì vậy, sự khám phá axit hữu cơ trong cây bứa tại Việt Nam là hết sức cần thiết, cây bứa có tên khoa học là Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth., thuộc họ Bứa (họ măng cụt) - Clusiaceae. Bài báo này trình bày phương pháp chiết tách, xác định thành phần axit hữu cơ chính có trong lá, vỏ quả măng cụt và các thông số vật lý khác. 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu Lá, vỏ quả của cây măng cụt (Garcinia oblongifolia Champ. ex Benth.) tại xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP. Đà Nẵng và từ thành phố Hồ Chí Minh. COOHC H HO COOHHO C COOHCH H COOHC H COOHHO C CH H C=OO H×nh 1: CÊu tróc cña (-) axit hydroxy citric vµ lacton cña (-) axit hydroxy citric lặp lại 01 lần 10 g mẫu (cắt nhỏ) + 100 mL nước Nồi áp suất 0,15 MPa, 30 phút Lọc bằng vải muslin Trộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than hoạt tính: ngâm trong nước ấm 30' Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính được rửa 02 lần với 15 mL nước và lọc lại nước rửa Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặt đến 20mL, xử lý với 100mL etanol để 15 phút để kết tủa hết pectin. Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 02 lần với 20mL etanol và ly tâm để thu hồi hết axit. Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể tích 50 mL và lưu giữ ở 40C đến khi sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, IR). 25 g mẫu+axeton hoặc etanol (150 mL) Chiết Soxhlet ở 75 0C trong 8 giờ Lọc bằng giấy lọc và cô đặc Etanol và axeton chiêt hòa tan trong 20mL nước + 4g than hoạt tính Ngâm trong nước ấm 30 phút và lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính được rửa 02 lần với 10 mL nước. Dịch chiết góp chung thành 50 mL (chuẩn độ, chạy HPLC, IR) lặp lại 01 lần 10 g mẫu + 150 mL nước Nồi áp suất 0,15 MPa, 60 phút Lọc bằng vải muslin Trộn lẫn dịch 02 lần chiết + 4g than hoạt tính: ngâm trong nước ấm 30' Lọc bằng giấy lọc, than hoạt tính được rửa 02 lần với 15 mL nước và lọc lại nước rửa Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặt đến 50mL, xử lý với 100mL etanol để 15 phút để kết tủa hết pectin. Ly tâm 10 phút, tách phần dịch nổi và kết tủa riêng. Phần kết tủa rửa 02 lần với 20mL etanol và ly tâm để thu hồi hết axit. Trộn các dịch nổi, cô đặc đến thể tích 50 mL và lưu giữ ở 40C đến khi sử dụng (chuẩn độ, chạy HPLC, IR). Nguyên liệu nghiên cứu lá, vỏ quả măng cụt được chuẩn bị theo sơ đồ ở phần 2.2.1. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Lá bứa: loại bỏ lá già, lá sâu, rửa sạch, hong khô tiến hành đo độ ẩm và thực hiện chiết tách axit theo sơ đồ sau. Quả bứa: loại bỏ quả hư, dập, quả chưa chín, rửa sạch, hong khô, tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ tiến hành xác định độ ẩm và sấy khô ở nhiệt độ 800C, xoay nhỏ làm nguyên liệu để chiết tách axit theo 02 phương pháp ở sơ đồ sau. Lá: Vỏ quả khô: Phương pháp 1: Phương pháp 2: 2.2.2. Phương pháp chiết tách Chưng ninh trong nồi áp suất: Lá, vỏ quả bứa tươi hoặc khô được cắt nhỏ rồi cho vào cốc thuỷ tinh 500 ml, chưng ninh trong nồi áp suất ở áp suất 0,15 MPa, nhiệt độ 127 oC trong thời gian 30-60 phút và lặp lại 02 lần để chiết tách hết lượng axit hữu cơ có trong mẫu với dung môi là nước. Chiết soxhlet: Vỏ quả bứa khô xoay nhỏ cho vào bộ chiết soxhlet tiến hành chiết ở nhiệt độ 75 oC, trong vòng 8 giờ với dung môi là axeton hoặc methanol. 2.2.3. Phương pháp trọng lượng Cân khoảng 10g lá, vỏ quả Bứa tươi cho vào cốc thuỷ tinh đã được sấy khô và biết khối lượng chính xác. Cho cốc thuỷ tinh có chứa lá, vỏ quả Bứa vào tủ sấy và sấy ở 80oC. Sau khi sấy khoảng 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thuỷ tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lượng trên cân phân tích. Sau đó, cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0.005g thì dừng quá trình sấy. Dựa vào các kết quả thu được, ta tính được khối lượng lá, vỏ quả Bứa trước và sau khi sấy. Từ đó, ta tính được độ ẩm lá dựa vào công thức sau: Trong đó: H: độ ẩm (%); m0: khối lượng lá hoặc vỏ quả tươi trước khi sấy (g); m1: khối lượng lá hoặc vỏ quả sau khi sấy (g). 2.2.4. Phương pháp chuẩn độ [2] Xác định hàm lượng axit tổng số trong lá, vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88. Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững. Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X1) tính bằng công thức: 100.10 m mmH −= P 100 . V Vcd .n.KX1 = trong đó: n: số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd: thể tích mẫu cô đặc; P: trọng lượng mẫu thử, tính bằng gam; K: hệ số của loại axit, K = 0,006904. 2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ (IR) Các phân tử luôn dao động không ngừng. Tần số dao động của các phân tử phụ thuộc vào hằng số lực của liên kết và khối lượng của chúng, do đó các nhóm chức khác nhau sẽ có tần số hấp thụ khác nhau nằm trong vùng từ 5000 – 200 cm-1. Mỗi nhóm nguyên tử (nhóm chức) xác định có tần số xác định và không đổi trong bất kỳ hợp chất nào có chứa nhóm nguyên tử đó. Vì vậy, khi phân tích trên quang phổ hồng ngoại ta có thể xác định được các nhóm nguyên tử mà chất đem phân tích có được. 2.2.6. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [3] [4] Chất chuẩn là (-)-Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào cốc 50-mL chứa 5.0 mL nước, và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp được khuấy trong thời gian 10 phút sử dụng khấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa được rửa với nước có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch dược trộn lẫn và làm thành 25 mL, khuấy trộn, và lọc sử dụng giấy lọc. Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 ppm đến 320 ppm. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit xitric cho HPLC: Dung dịch chuẩn axit xitric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nước cất 3 lần cất. HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại low pressure hãng Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5µm. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò được thực hiện bằng đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190-740 nm. Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là axit photphoric 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10-30% trong thời gian 0-25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45 µm và tiêm vào HPLC. Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn được thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10-320 ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải được thực hiện như phần thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Đường cong HCA được vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 03 lần chạy). Tương tự, đường chuẩn của axit xitric được tiêm vào HPLC, được thực hiện như cách thảo luận trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dưới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ). Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) được định nghĩa như nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%. Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu được chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nước cất 02 lần cất, ngoại trừ dịch chiết lá bứa pha loãng với tỉ lệ 1:25, quả chiết bằng methanol tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu được tiêm vào HPLC là 20 µL, HCA, axit xitric thu được trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng đường chuẩn. Nồng độ của HCA và axit xitric trong mẫu được trình bày bằng g/100 g mẫu. Phương pháp chuẩn độ axit-bazơ có thể sử dụng để xác định axit hữu cơ trong dịch chiết, phương pháp này giúp ta xác định được tổng lượng axit có trong dịch chiết. Tuy nhiên, trong phương pháp này không thể định lượng axit (-) hyđroxy xitric và axit xitric một cách riêng biệt. Ta cũng có thể xác định các axit bằng phương pháp sắc kí khí, trong phương pháp sắc kí khí ta phải sấy mẫu. Nhưng axit HCA sẽ bị lacton hoá khi có tác nhân nhiệt. Trong phương pháp sắc kí lỏng cao áp, ta có thể định lượng HCA và các axit hữu cơ khác mà không cần phải cô đặc, sấy, hoá hơi dung dịch chiết. Đây là điểm thuận lợi để có thể định lượng (- )-HCA và các axit hữu cơ một cách riêng biệt. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá vỏ quả măng cụt Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả bứa được trình bày trong bảng 1 sau đây: Bảng 1. Kết quả xác định độ ẩm trong lá, vỏ quả Măng cụt Mẫu Stt mẫu Khối lượng lá trước khi sấy (g) Khối lượng lá sau khi sấy (g) Khối lượng nước trong lá (g) Độ ẩm (%) 1 9.726 2.789 6.937 71.32 2 9.96 2.898 7.062 70.9 Lá bứa 3 10.172 3.022 4.17 70.49 1 10.6012 1.6767 8.9245 84.18 2 9.7521 1.547 8.2051 84.14 Vỏ quả bứa 3 10.5966 1.6458 8.9508 84.47 Từ kết quả trên cho thấy độ ẩm trong lá Bứa tươi khoảng 70,70 ± 0,62 %, độ ẩm trung bình trong lá là 70,70 %. Độ ẩm trong lá Măng cụt cao, chiếm khoảng 70% khối lượng lá. Độ ẩm trong vỏ quả măng cụt khoảng 84,31 ± 0,16 %, độ ẩm trung bình trong vỏ quả là 84,31 %. Độ ẩm trong vỏ quả măng cụt là rất cao, chiếm khoảng 84 % khối lượng vỏ quả. 3.2. Kết quả xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại (IR) Kết quả chụp phổ IR cho thấy xuất hiện pic có bước sóng từ 3300 – 3600 cm-1, đó là phổ dao động của nhóm –OH có liên kết hiđro, và pic có bước sóng từ 1600 – 1800 cm-1, là phổ của nhóm C=O trong nhóm – COOH (hình 2, 3). 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 Ab so rb an ce 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 Ab so rb an c e 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1) Hình 2: Phổ IR mẫu vỏ quả bứa chiết trong nước Hình 3: Phổ IR mẫu lá bứa chiết trong nước Từ những phổ hồng ngoại trên, có thể kết luận trong mẫu chiết từ nước của lá và vỏ quả măng cụt có sự tồn tại của axit hữu cơ có nhóm –OH. 3.3. Kết quả xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả măng cụt Bảng 2: So sánh axit hữu cơ trong lá, vỏ quả măng cụt bằng HPLC và phương pháp chuẩn độ Axit hữu cơ xác định bằng HPLC (g/100 g) Mẫu Dung môi chiết HCA Axit xitric Chuẩn độ axit-bazơ (g/100g) Lá bứa Nước 2,863 0 3,554 Vỏ quả bứa khô Nước 15,221 0,406 17,468 Vỏ quả bứa khô Axeton 12,999 0,239 13,711 Vỏ quả bứa khô Metanol 9,508 0,078 10,492 Số mẫu n=3, kết quả tính trung bình Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp và phương pháp chuẩn độ được thể hiện trong bảng 2. Tổng axit xác định bằng phương pháp chuẩn độ axit-bazơ có kết quả lớn hơn tổng axit xác định bằng HPLC. Từ bảng trên cho thấy, chiết bằng dung môi nước cho lượng axit là lớn nhất, tiếp đến là axeton và metanol. Giá trị thu được chủ yếu của phương pháp HPLC được tính đến chỉ là HCA, bởi vì giá trị thu được từ diện tích pic của HCA lớn nhất. Axit chủ yếu được tìm thấy trong lá, vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA, được thể hiện trên sắc kí đồ hình 5, 6, 7, 8. Pic thứ yếu được xác định là pic của axit xitric. Trên sắc kí đồ, HCA cho pic đơn trong tất cả các mẫu chiết. Riêng đối với mẫu lá bứa chiết trong nước không xuất hiện pic của axit xitric. Xác định pic HCA được dựa vào pic của axit HCA chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 4,939 phút, tương tự pic của axit xitric xác định nhờ pic axit chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 5,623 phút (hình 4). Thời gian lưu của HCA và axit xitric được tìm thấy trong tất cả các mẫu lần lượt là 4,992 ± 0,065, 5,609 ± 0,010 phút. Đường chuẩn được xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng với nồng độ từ 10 đến 320 ppm, phương trình đường chuẩn: C = 1,37A-6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA, hệ số tương quan R2=0,999698. Hình 4. Sắc kí đồ mẫu axit HCA và axit xitric chuẩn Hình 5. Sắc kí đồ mẫu vỏ quả măng cụt khô chiết trong metanol Hình 6: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả măng cụt khô chiết trong nước Hình 7: Sắc kí đồ mẫu vỏ quả măng cụt khô chiế