Vector chuyển gen là plasmid

Vector chuyển gen là plasmid Các plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Tùy các kiểu của plasmid mà số bản sao plasmid bởi vi khuẩn sẽ khác nhau. Một số plasmid chỉ có một bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần trong mổi lần phân bào. Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được nhiều lần trong mỗi chu kỳ phân bào. Những plasmid có từ 10 đến 100 bản sao trong tế bào chủ được xem như plasmid có bản sao cao. Plasmid khác có từ 1 đến 4 bản sao trong tế bào chủ, được xếp vào nhóm có bản sao thấp. Trong sinh vật eucaryote, plasmid chỉ có trong tế bào nấm men. Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng tự tái bản DNA. Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, DNA không thể tự tái lập trong tế bào chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector chuyển gen để nhân dòng DNA cần thiết. Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid không ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng. Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA. 1. Các plasmid thế hệ thứ nhất Thế hệ đầu tiên đó là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên pSC101 (Stalay- Cohen), ColE1 đã góp phần đầu tiên vào lịch sử tạo dòng. Tuy vậy các plasmid này có rất ít những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên vào một cấu trúc duy nhất. 2. Plasmid thế hệ thứ hai pBR322 - là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân dòng trong tế bào E. Coli. Nó được tìm ra vào năm 1977 bởi Bolivar Rodrigues. Các plasmid thế hệ thứ 2 được cấu tạo phức tạp hơn bắt nguồn từ plasmid nhỏ và được cấu tạo thêm nhiều đoạn gen quí. Cấu tạo plasmid pBR322 pBR322 có kích thước 4.363bp và hai gen kháng thuốc, một chống chịu được ampicilline (ampR) và một chống chịu được tetracycline (tetR) Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh. Ví dụ, gen kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI. Việc cài DNA lạ được tiến hành một trong hai gen kháng thuốc. Nếu chỉ còn một gen kháng với kháng sinh là do một trong hai gen đã không nhận đoạn cài. Điều này cho phép để chọn lựa các plasmid tái tổ hợp. Một ứng dụng nữa của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt. 3. Các plasmid thế hệ ba Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn. Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn: - Dãy pUC như: pUC18 , pUC19 (Hình 5-3) - Dãy Gemini: Plasmid pGEM3 , Plasmid pCR 2.1 - Nhóm các plasmid Bluescript Dãy pUC: pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb và có một số đặc trưng sau: - Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để tổng hợp enzyme β-galactosidase. - Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn của 13 enzyme cắt hạn chế. - Ở pUC18 , vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI, HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III). - Ở pUC19 , vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III .....EcoRI). - Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein (enzyme) vốn được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh chất của vi khuẩn. Cấu tạo plasmid pUC Sự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid. Sự có mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy trên môi trường có ampicilline. Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn. Plasmid pGEM3 : Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini) Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) và vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương tự như vùng polylineker của pUC19 . Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 và T7 ở hai bên vùng polylinker. Vì vậy có ưu điểm là cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA. 3. Nhóm các plasmid bluescript: Bluescrip là vector lai nhân tạo phage sợi và plasmid vì vậy nó được kết hợp tất cả những ưu điểm của các phage và ưu điểm của các plasmid, có thể xem đó là nhóm có tiềm năng nhất hiện nay. Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng 2.961bp (Hình 5-5), bao gồm: Cấu tạo pBluescript SK (+/-) - Một mảnh lacZ ở đầu 5’ của gen này có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI hoặc ngược lại. Ở vùng polylinker người ta còn tìm thấy một vùng nhận biết tương đối hiếm (NotI) mà không có ở dãy pUC. Với 2 promoter T3 và T7 để thu được đoạn cài RNA cùng chiều hoặc ngược chiều qua việc sử dụng RNA- polymerase của phage T3 nhận biết promoter T3 hoặc ngược lại. - Một mảnh DNA của phage tùy mục đích sử dụng có thể là phage M13 hoặc phage f1 .Vùng này sẽ sử dụng khi người ta muốn DNA tái bản dưới dạng sợi đơn hoặc sợi đôi, ngoài ra ở vùng này còn chứa điểm khởi đầu cho sự tái bản (ori). Song sự tái bản chỉ có thể xảy ra bởi sự đồng gây nhiễm với một virus trợ giúp (virus helper). Virus này sẽ bổ khuyết những chức năng thiếu bằng cách mang đến những gen mã hóa các enzyme cần thiết cho sự tái bản. Phụ thuộc vào sự cài đặt của mảnh DNA này so với chiều của gen lacZ, người ta sẽ có vector bluescipt + hoặc −. Cặp này cho phép nhận được sợi cùng chiều hoặc ngược chiều. Một gen chống chịu được ampicilline, gen này cho phép chọn lựa tất cả những vi khuẩn đã sát nhập một bluescript. Trong vector bluescript còn có điểm khởi đầu sao chép colEI ori, chuỗi này cho phép nhân bản của phagemid (bluenscript) ở trong E. Coli như plasmid. Giống gốc E. Coli được sử dụng thường là XL1Blu, trong bộ máy di truyền của chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp tetracycline. Điều này cho phép dễ dàng chọn lựa những vector đã sát nhập vào vi khuẩn. Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta có thể sử dụng bluescript để nhân bản một đoạn DNA sợi đơn hoặc sợi kép hoặc sao chép RNA invitro để sản xuất đầu dò lai hóa hoặc tạo ngân hàng cDNA.