Bài 1: Giới thiệu về nuôi cấy tế bào động vật

Giới thiệu về nuôi cấy tế bào động vật TS. Phạm văn Phúc PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc Bộ môn Sinh lí động vật và CNSH Động vật Experimental Methods 2006 2 Mục tiêu •  Sau khi học bài này, sinh viên có thể: –  Thế nào là nuôi cấy mô và các kiểu nuôi cấy mô –  Ứng dụng của nuôi cấy mô –  Thuận lợi và bất lợi của mỗi kiểu nuôi cấy mô –  Một số khái niệm cơ bản Experimental Methods 2006 3 Nuôi cấy mô là gì? •  Nuôi cấy In vitro (duy trì và/hay tăng sinh) các tế bào, mô và các cơ quan •  Các kiểu nuôi cấy mô –  Nuôi cấy cơ quan –  Nuôi cấy mô –  Nuôi cấy tế bào Experimental Methods 2006 4 Experimental Methods 2006 5 Experimental Methods 2006 6 Experimental Methods 2006 7 Nuôi cấy cơ quan •  Nuôi cấy phôi hay cơ quan tách khỏi cơ thể •  Thuận lợi –  Chức năng sinh lí bình thường được duy trì –  Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn •  Bất lợi –  Không thể nuôi cấy quy mô lớn –  Phát triển chậm –  Fresh explantation is required for every experiment. Experimental Methods 2006 8 Experimental Methods 2006 9 Nuôi cấy mô •  Các mảnh của mô được phát triển trong môi trường nuôi cấy •  Thuận lợi –  Một số chức năng bình thường được duy trì –  Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành) •  Bất lợi –  Tổ chức ban đầu của mô mất Experimental Methods 2006 10 Nuôi cấy tế bào •  Mô được tách thành tế bào đơn, hầu hết là bằng enzyme, thành huyền phù tế bào được nuôi cấy in vitro như monolayer hay nuôi cấy huyền phù •  Thuận lợi –  Phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ –  Có thể nuôi cấy quy mô lớn •  Bất lợi –  Tế bào mất một số đặc tính đã biệt hóa trong mô Experimental Methods 2006 11 EMP04 12 Experimental Methods 2006 13 Tại sao cần nuôi cấy mô? •  Nghiên cứu –  Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như: • Các tác động của các mô xung quanh • Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật –  Giảm các động vật sử dụng •  Sản xuất các sản phẩm thương mại –  vaccine, antibody, hormone –  Tế bào sử dụng cho cấy ghép 14 Các kiểu nuôi cấy tế bào 1.  Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture) –  Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như •  Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy •  Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học) –  Thuận lợi: •  Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo. –  Bất lợi: •  Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast •  Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức •  Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn 15 2. Nuôi cấy thứ cấp –  Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp •  Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy –  Thường chứa kiểu êế bào đơn –  Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ –  Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy: •  Dòng tế bào •  Dòng tế bào liên tục Các kiểu nuôi cấy tế bào Experimental Methods 2006 16 1)  Dòng tế bào •  Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia) •  Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa •  Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài Các kiểu nuôi cấy tế bào Experimental Methods 2006 17 2)  Dòng tế bào liên tục •  Có thể tăng sinh không hạn định •  Chúng thường là những tế bào chuyển dạng: –  Tế bào từ khối u. –  Nhiễm với các viral oncogenes –  Xử lí hóa chất (chemical treatments). •  Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo. Experimental Methods 2006 18 Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection) •  Chuyển dạng –  Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen • Tốc độ phát triển • Kiểu phát triển (loss of contact inhibition) • Hình thành sản phẩm chuyên biệt • Kéo dài tuổi thọ • Mất khả năng bám dính •  Chuyển nhiễm –  Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA) Experimental Methods 2006 19 Khởi sự một nuôi cấy Mô Nuôi cấy tế bào sơ cấp Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục Phân tách Cấy chuyền Hạn định số lượng Không hạn định số lượng Bảo quản Bảo quản SINH HỌC TẾ BÀO NUÔI CẤY 20 21 Chu kì tế bào M Mitosis G1 Gap1 G2 Gap2 G0 S Synthesis G1 check point •  cell big •  environment suitable G2 check point •  DNA replicated •  cell big •  environment suitable Metaphase check point •  chromosome align on spindle 22 Chu kì tế bào •  Interphase: –  Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú –  Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước •  Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia •  Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint •  S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra •  Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2 Checkpoint •  Mitosis hay M Phase: –  Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng –  Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau. –  Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ –  Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia. 23 SỰ TĂNG SINH IN VITRO • Sự TĂNG SINH của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc: –  Trạng thái tự nhiên của tế bào: •  Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick •  Vai trò của sự biểu hiện gen –  Môi trường nuôi cấy • Cơ chất tế bào bám • Thành sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi • Thành phần của phase khí • Nhiệt độ nuôi • Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền 24 KÌM HÃM TIẾP XÚC - ĐIỀU HOÀ SỰ TĂNG SINH •  Kìm hãm tiếp xúc •  Kích thích sự tăng sinh –  Mật độ thấp –  Các tín hiệu từ môi trường: các nhân tố tăng trưởng • Ức chế sự tăng sinh –  Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao –  Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào –  Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene product 25 SỰ BIỆT HOÁ IN VITRO •  Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các chức năng tế bào bình thường •  Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào: –  Mật độ tế bào cao –  Tương tác tế bào-tế bào và tương tác tế bào- chất nền –  Chất cảm ứng: hydrocortisone, retinoid, matrix 26 SỰ BÁM DÍNH IN VITRO •  Sự bám dính tế bào là cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa •  Các phân tử bám dính tế bào: –  Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins –  Tương tác tế bào-chất nền: integrin, transmembrame proteoglycan •  Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex) trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào- tế bào. Experimental Methods 2006 27 Các nhân tố ảnh hưởng đến sự bám dính •  Sự phân tách bằng enzyme tiêu hủy các phân tử bám dính và chất nền ngoại bào •  Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng monolayer •  Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng sinh và biệt hóa` Experimental Methods 2006 28 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của nuôi cấy tế bào •  Tế bào thích hợp •  Điều kiện thích hợp –  Phase rắn •  Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plastic, collagen, agar –  Phase lỏnt •  Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành phần môi trường nuôi –  Phase khí –  Nhiệt độ –  Độ vô trùng của môi trường Experimental Methods 2006 29 Pha rắn •  Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển •  Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic •  Những cơ chất khác như glass, filter wells •  Bề mặt có têể được xử lí với: –  Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l- lysine, matrigel –  Lớp feeder: monolayer of supporting cells, perhaps promote cell growth and differentiation by cell contact and substance secreted •  Neurons on glial cell feeder layers Experimental Methods 2006 30 Phase lỏng •  Thành phần của môi trường –  Muối vô cơ • Cân bằng áp suất thẩm thấu • Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions. • Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor. –  Carbohydrate • Hầu hết chứa 4-20 mM glucose • Nguồn năng lượng: glycolysis Experimental Methods 2006 31 Phase lỏng –  Proteins and Peptides • Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg. transferrin, fibronectin –  Amino acids • Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa • glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle –  Fatty Acids and Lipid • Quan trọng trong môi trường serum free media e.g. cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt. Experimental Methods 2006 32 Phase lỏng –  Vitamin • vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh • Tiền chất cho các co-factors • Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin –  Trace Element • zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid intermediates. • Selenium is a detoxifier và giúp tách các gốc O2 tự do Experimental Methods 2006 33 Phase lỏng –  Hệ đệm • Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4 • Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu: –  Hệ thống đệm bicarbonate/CO2 –  Hệ đệm hóa chất: HEPES • Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator –  vàng (acid) hay hồng (alkali) –  Áp suất thẩm thấu • Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm Experimental Methods 2006 34 Phase lỏng –  Huyết thanh • Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors • Gia tăng khả năng đệm • Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc • Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp • Biến thiến từng mẻ • Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm Experimental Methods 2006 35 Phase khí –  Carbondioxide •  Quan trọng cho hệ đệm –  5-10% CO2 –  Sản xuất sản phẩm: pyruvate –  Oxy •  Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp •  anaerobic glycolysis •  Nồng độ oxy cao có thể gia tăng gốc O2 tự do H3C C C O − O O C S O H3C CoA HSCo A NAD+ NADH + CO2 Pyruvate Dehydrogenase pyruvate acetyl-CoA Experimental Methods 2006 36 Hình dạng tế bào khi nuôi •  Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính: –  Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào) •  Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma) –  Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi. •  Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts Hela-Epithelial MRC5-Fibroblast SHSY5Y-Neuronal BAE1-Endothelial Experimental Methods 2006 37 Nhiệt độ –  Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài • Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận • Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body) Experimental Methods 2006 38 Kĩ thuật vô trùng •  Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong nuôi cấy tế bào •  Ngăn ngừa sự nhiễm: –  Kháng sinh –  Cải thiện điều kiện PTN –  Kĩ thuật vô trùng • Bề mặt sạch và gọn gàng • Người “sạch” –  Rửa tay –  Nón, khẩu trang, găng tay • Hóa chất và môi trường • Dụng cụ nuôi cấy Experimental Methods 2006 39 Đông lạnh dòng tế bào •  The aim of cryopreservation is to enable stocks of cells to be stored to prevent the need to have all cell lines in culture at all times •  Reduced risk of microbial contamination •  Reduced risk of cross contamination with other cell lines •  Reduced risk of genetic drift and morphological changes •  Work conducted using cells at a consistent passage number •  Reduced costs (consumables and staff time) Đông lạnh dòng tế bào Method Advantages Disadvantages Electric (-135ºC) Freezer •  Ease of maintenance •  Steady temperature •  Low running costs •  Requires liquid nitrogen back-up •  Mechanically complex •  Storage temperatures high relative to liquid nitrogen Liquid Phase Nitrogen •  Steady ultra-low (-196ºC) temperature •  Simplicity and mechanical reliability •  Requires regular supply of liquid nitrogen •  High running costs •  Risk of cross- contamination via the liquid nitrogen •  - 196ºC Vapor Phase Nitrogen •  No risk of cross- contamination from liquid nitrogen •  Low temperatures achieved •  Simplicity and reliability •  Requires regular supply of liquid nitrogen •  High running costs •  Temperature fluctuations between - 135ºC and - 190ºC 41 Đánh giá rủi ro Risks depend on: •  Source of material •  the nature of operation being carried out Assesment: •  Pathogenicity •  Route of transmission •  Agent stability •  Infectious dose •  Concentration •  Availability of data from animal studies •  Availability of an effective prophylaxis •  Medical surveillance •  Experience and skill level of at-risk personnel Experimental Methods 2006 42 Risk groups for animal cell culture •  The level of risk depends on the cell line to be used and is based on whether the cell line is likely to cause harm to humans. •  Low risk –  Non human/non primate continuous cell lines and some well characterized human diploid lines of finite lifespan •  Medium risk –  Poorly characterized mammalian cell lines. •  High risk –  Cell lines derived from human/primate tissue or blood. –  Cell lines with endogenous pathogens (the precise categorization is dependent upon the pathogen) –  Cell lines used following experimental infection where the categorization is dependent upon the infecting agent Experimental Methods 2006 43 Safety aspects of cell culture •  SAFETY CONSIDERATIONS •  Assume all cultures are hazardous since they may harbor latent viruses or other organisms •  The following safety precautions should also be observed: –  pipetting: use pipette aids to prevent ingestion –  keep aerosols down to a minimum –  no eating, drinking, or smoking –  wash hands after handling cultures and before leaving the lab –  decontaminate work surfaces with disinfectant (before and after) –  autoclave all waste –  use biological safety cabinet (laminar flow hood) –  use aseptic technique –  dispose of all liquid waste after each experiment and treat with bleach 44 Risk Group (RG) Classification is based on the potential effect of biological agent on healthy human adult •  RG1-agents are not associated with disease •  RG2-agents are associated with human disease which is rarely serious and for which preventive or therapeutic interventions are often available •  RG3-agents are associated with serious or lethal human disease for which preventive or therapeutic interventions may be available •  RG4-agents are likely to cause serious or lethal human disease for which preventive or therapeutic interventions are not usually available