Bài 6: Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng tế bào động vật

Kỹ thuật cấy chuyền và tạo dòng tế bào động vật ThS. Phan Lữ Chính Nhân Nội dung Nhắc lại Kỹ thuật cấy chuyền Tạo dòng tế bào Các ứng dụng THU NHẬN MẪU MÔ CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Nuôi mẫu mô sơ cấp Thu nhận tế bào mới Thu mảnh mô thứ cấp Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép) NUÔI SƠ CẤP Cấy chuyền DÒNG TẾ BÀO Tách tế bào bằng enzym (ủ) Trypsin lạnh Trypsin ấm Ly tâm Collagenas e Tái huyền phù 4Thu nhận cơ quan Cell line Cấy chuyền Cấy chuyền Nuôi sơ cấp Nuôi mô Cắt nhỏ Thành tế bào đơn Nuôi sơ cấp 5 Tách rời tế bào Tách bằng tác nhân khác (EDTA) Tách bằng enzym Trypsin Trypsin ấm Trypsin lạnh Collagenase Papain Elastas Tách bằng enzyme MỘT SỐ ENZYME PHÂN CẮT THƯỜNG DÙNG Trypsin: Chymotrypsin Collagenase Papain Elastase • pH6-9, tối ưu 8-9 • Nồng độ dùng: 0,01%-0,5% • Ca2+ được xem như chất bảo vệ Trypsin • Bị kìm hãm bởi FBS hoặc Di-Isopropyl- Fluorophosphat(DFP) • Không đặc hiệu cho loại protein: Cắt liên kết –COOH của lysin/arginin và –NH2  có thể gây hư hai cho tế bào • pH 7-9, thích hợp 8-9 • Cắt liên kết peptide tạo bởi –COOH acid amin thơm với – NH2 • Tính đặc hiệu kém hơn trypsin • Bị ức chế bởi DFB • • Hoạt động tốt: pH7-8, < 450C • Cắt liên kết peptide dạng poly-L prolin; gồm 4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên biệt ít làm hư hại tế bào • pH 4,5-8,5 • Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá • Phân huỷ elastin • Sử dụng kết hợp với enzyme khác Tế bào bám dính 8 Tế bào không bám dính Sau nuôi sơ cấp, tế bào bám vào bề mặt đĩa nuôi Sau 1 thời gian, tế bào tăng sinh, bao phủ đầy bề mặt đĩa nuôi Thêm enzym (trypsin, collagenase) Tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi, chuyển qua các đĩa nuôi khác Sau cấy chuyền, tế bào tiếp tục tăng sinh 1 23 1. Huyền phù để tách rời cụm tế bào thành tế bào đơn 2. Pha loãng mật độ tế bào, chuyển sang các đĩa nuôi mới 3. Tế bào đơn với mật độ thưa trong đĩa nuôi mới Cụm tế bào nuôi sơ cấp Puck và Marcus (1955) Lưu ý • Hạn chế tối đa thời gian tiếp xúc của enzyme phân tách với tế bào • Chọn nồng độ tối thiểu enzyme phân tách tuỳ loại tế bào • Sử dụng các chất ức chế hoạt tính enzym ngay sau khi phân tách (FBS, protease inhibitor) TẠO DÒNG TẾ BÀO KHÁI NIỆM- ĐẶC TÍNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN 11 12 (Regenerative Medicine, 2006) 13 Tăng sinh 14 Tiêu chí lựa chọn dòng tế bào cho thí nghiệm • Loài • Đặc điểm chức năng • Hữu hạn hay liên tục • Bình thường hay chuyển dạng • Điều kiện và đặc tính tăng trưởng • Cùng kiểu gen, hình thái • quần thể tế bào như nhau ở đặc điểm quan tâm. 16 Mô Phân tách Tế bào đơn Nuôi sơ cấp Pha loãng tới hạn Vòng nhẫn Tách tế bào tự động Clone phát triển Douglas C. McFarland Methods in Cell Science 22: 63–66 (2000). 17 Giếng tế bào gốc C h u ỗ ip h a Lo ãn g lầ n 1 Chuỗi pha Loãng lần 2 19 Nhuộm crystal violet 21 • Sử dụng đĩa 96 giếng; 100 ul/giếng • Mật độ tế bào ban đầu: 200 - 4000 tế bào/giếng gốc • Giảm dần mật độ tế bào trong mỗi giếng • Nên cấy chuyền sang đĩa 24 12 6 giếng (đĩa 35 mm) flask 25 flask 75 VÒNG NHẪN (Cloning ring) 23 Phân lập Clones (Huyền phù) 25 Xây dựng đường cong-đo sự phát triển Máy đếm tế bào tự động (Nucleocouter) Buồng đếm hồng cầu Đường cong tăng trưởng Xác định số lượng tế bào sau mỗi 24 giờ vẽ biểu đồ, xác định thời gian nhân đôi quần thể Thiết bị: máy đếm tế bào tự động, buồng đếm hồng cầu 27 28 In vivo In vitro: biệt hóa tế bào, nhuộm kiểm tra Phân tích flowcytometry 29 • dòng tế bào bị thoái hóa: Clone ko phát triển mãi, có thể biến đổi, đặc điểm mong muốn thay đổi • 1 tế bào khó sốngmôi trường đặc biệt, bổ sung GF, đồng nuôi cấy • Dòng tế bào có vòng đời (thời gian phân chia) giới hạn, sau vài lần cấy chuyền sẽ lão suy • Đại thực bào và tế bào thần kinh không phân chia in vitro --> có thể dùng như nuôi sơ cấp 30 31 32 • TBG được thu nhận và cấy ghép vào 1 phần mô người, hỗ trợ sự phát triển cơ quan Cloning from adults • Tiến bộ trong hiểu biết về ung thư • Tiến bộ trong sinh học tế bào • Công nghệ máu cuống rốn, bệnh leukemia, thải loại trong cấy ghép • Công nghệ chuyển nhân tế bào sinh dưỡng (SCNT) • Sản xuất tế bào đột biến • Phát hiện thuốc và quá trình biến dưỡng 35 • Cải tiến di truyền: tăng năng suất tạo sản phẩm sinh học • Dòng tế bào ung thư: thử nghiệm chất kháng phân bào • Dòng fibroblast: thử nghiệm tính gây kích thích của mỹ phẩm 36