Bài giảng Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn hydratcarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chỉ thị màu Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37oC/24 h Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu E. coli Enterobacter aerogenes Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển Âm tính: không đổi màu 2. Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý - Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H2O2 . Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện - Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả 3. Thử nghiệm Oxydase Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có Oxydase (+) Lấy một ít chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc. Nhỏ thuốc thử(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) - Phản ứng dương tính: có màu tím. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu Phản ứng Oxydase sử dụng thuốc thử (N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) Phản ứng dương tính: có màu tím. Phản ứng xuất hiện trong vòng 10 giây đầu. 4. Thử nghiệm phân giải Ure Nguyên tắc: phát hiện enzym urease phân giải urea thành ammonia và carbondioxide. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. Là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus. Cấy vi khuẩn vào canh thang Ure. Ủ 37oC/24 – 48 h Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ. Phản ứng âm tính: không chuyển màu Dương tính: môi trường chuyển thành màu tím Âm tính: không màu 5. Thử nghiệm Coagulase (đông huyết tương) Nguyên tắc: Phát hiện sự có mặt của men Coagulase bằng phản ứng đông huyết tương thỏ Là phản ứng phân biệt tụ cầu gây bệnh và không gây bệnh Cho vào ống nghiệm 0,5 ml huyết tương thỏ và 0,5 ml dịch cấy vi khuẩn. Ủ ấm 37oC/4-24h Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính. Dương tính: hình thành khối đông huyết tương 6. Thử nghiệm sinh Idol Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển hóa trypton tạo thành indol - Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37oC/24 h - Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản ứng âm tính - Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h Dương tính: màu đỏ cánh sen Âm tính: màu vàng 7. Thử nghiệm MR Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền. - VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm - VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung tính) - Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP. Ủ 37oC từ 2-5 ngày - Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+) có màu đỏ, âm tính màu vàng 8. Thử nghiệm VP Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có ô xy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl Diacetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diacetyl – guanidin có màu đỏ Cấy vi khuẩn vào môi trường MR – VP. Ủ 37oC/24 – 48 h Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử B( KOH 40%). Lắc nhẹ Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 h Phản ứng (+): có màu đỏ trên mặt môi trường 9. Thử nghiệm lên men đường Nguyên tắc:Vi khuẩn có khả năng lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu của môi trường * PHƯƠNG PHÁP MPN: Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi Cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham. Ủ 37oC/24 – 48 h Vi khuẩn lên men đường lactose sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi trường và có bóng hơi trong ống Durham * Thử khả năng lên men đường A. Lactose broth Escherichia coli Proteus vulgaris Phản ứng dương tính: màu vàng, sinh hoặc không sinh hơi Phản ứng âm tính: không đổi màu Sinh hơi à hình thành bóng hơi trong ống durham * LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H2S (TSI) Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose Cấy hai bước - Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng - Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ 37oC/24h Nếu chỉ lên men Glucose. - Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu nuôi cấy. - Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone à phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường) - Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 à phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng * LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose - Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng - Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong điều kiện hiếu khí. - Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch - Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân thạch có màu đen (H2S +) 10. Thử nghiệm khử nitrat Nguyên tắc: Phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit và ni tơ phân tử - Một số vi khuẩn có khả năng khử NO3 thành NO2 và các hợp chất chứa Nitơ khác như amonia (NH3) và khí Nitơ (N2) NO3 ----> NO2 ----> NH3 or N2 - Nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat,ủ ở 370 C/24h. Sau đó nhỏ thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và sulfanilic acid . Hai hợp chất này kết hợp với nitrit để tạo thành HC có màu đỏ (phản ứng dương tính). * Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat dương tính. Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau: Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường) 11. Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu) - Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy trên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có ba dạng tan máu: Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc Tan máu (γ): không có vùng tan máu 12. Thử nghiệm khả năng di động Nguyên tắc: phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế bào. Có thể thử khả năng di động bằng cách cấy đâm sâu trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37oC từ 18-24h Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch 13. Thử nghiệm hóa lỏng gelatin Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28oC Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase - Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14 ngày Phương pháp gelatin Strip Sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay đổi màu. Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm trong hai tuần. TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ±1oC trong thời gian từ 5 - 7 ngày. Số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g(ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ - DỤNG CỤ Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC. Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ±1oC. Tủ sấy khô. Nồi hấp áp lực . Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG Thạch dùng cho Vi sinh vật Pepton dùng cho Vi sinh vật Muối tinh khiết (NaCl) Glucoza tinh khiết Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4) Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4) Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40% Axit xitric dung dịch 20% Dung dịch NaOH 0,1N CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử - Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml nước pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Pha loãng mẫu - Chọn môi trường pha loãng: Sử dụng nước pepton hoặc nước đệm pepton nếu chỉ cần tính tổng số bào tử nấm men. - Sử dụng nước thạch hoặc nước pepton có thạch, nếu cần tính tổng số cả nấm men và nấm mốc hoặc chỉ có nấm mốc - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo. Pha loãng mẫu cho đến khi có đậm độ pha loãng cần thiết đếm được số khóm nấm trên đĩa theo dự tính. Đổ đĩa: - Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và một pipet đã tiệt khuẩn riêng. - Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri - Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1oC trong điều kiện vô khuẩn, điều chỉnh pH môi trường đến 4,5 - 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20%, 40% hoặc dung dịch axit xitric 20% - Rót vào từng đĩa 12-15 ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi ttrường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần - Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang - Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút Ủ ấm: - Khi thạch đã đông, để các đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28±1oC hoặc khi nhiệt độ phòng tương ứng trong 5 -7 ngày. Không lật ngược đĩa - Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm mốc mọc trên các đĩa (chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh hay lật ngược đĩa). - Sau 5-7 ngày đếm toàn bộ số nấm đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức. Đọc kết quả - Chọn tất cả các đĩa có số khóm nấm men từ 15 - 150, số khóm nấm mốc từ 5-50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. - Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. TÍNH KẾT QUẢ a. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N) bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dược trên các đĩa theo công thức sau: ΣC N = ------------------- (n1+ 0,1.n2) d - C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn - n1,n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đẫ chọn thứ 1 thứ 2 - d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1 (Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa) b. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng c. Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha lãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khóm nấm men hoặc ít hơn 5 khóm nấm mốc, tính kết quả theo trung bình cộng . d. Nếu tất cả các đĩa không có khóm nấm nào mọc, đánh giá kết quả như sau: - Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm khác. d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu 10-1 BÁO CÁO KẾT QUẢ - Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được tổng số BT nấm men–nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra - Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của phương pháp từ 12 đến 37% . TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP -Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ±1oC trong thời gian từ 24- 48 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khi trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm đựơc từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng. PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ DỤNG CỤ Các thiết bị thông thường của phòng VSV thực phẩm: Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC. Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1oC. Tủ sấy khô. Nồi hấp áp lực . Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG Thạch dùng cho vi sinh vật Pepton dùng cho vi sinh vật Muối tinh khiết (NaCl) Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4) Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4) Natri hydroxit tinh khiết (NaOH) Cao thịt. Cao men Trypton Glucose tinh khiết CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). Chuẩn bị mẫu - Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Pha loãng mẫu - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng. Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa petri Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1oC trong điều kiện vô khuẩn. Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 37 ± 1oC từ 24- 48 giờ. ĐỌC KẾT QUẢ Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức. Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. TÍNH KẾT QUẢ Chọn những đĩa có từ 15-300 khuẩn lạc của hai đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả N = TÍNH KẾT QUẢ C:Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn n1,n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất Sau đó làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n ( n là số mũ thích hợp của 10). VD: - Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 150 và215 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 16 và 25 khuẩn lạc 150+215+16+25 N = ---------------------- = 18480 = 1,8 x 104 CFU/g/ml (2+0,1 x 2) x 10-2 * Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng, VD - Ở đậm độ pha loãng 10-2có 180 và 250 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10-3 có 60 và 75 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn (10-2 )để tính kết quả. 180 + 250 N = --------------- = 21500 2 x 10-2 Kết quả: 2,0 x102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm * Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm. VD - Ở đậm độ pha loãng 10-1của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc - Ở đậm độ pha loãng 10-2 có 6 và 7 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10-2 để tính kết quả. 12 + 8 N = --------------- = 100 2 x 10-1 Kết quả :1,0 x 102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm * Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quả như sau: - Ít hơn 1 vi sinh vật hiếu khí trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d vi sinh vật hiếu khí trong 1g sản phẩm khác d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (thường là10-1) BÁO CÁO KẾT QUẢ Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của phương pháp từ 12 đến 37% ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) Định nghĩa Coliform cổ điển Coliforms: Lên men lactose sinh acid và gas - Escherichia coli - Klebsiella - Enterobacter - Citrobacter Sinh acid và gas do lên men lactose ở 37°C: 95% là coliform Sinh acid và gas ở 44°C : 90 % là E.coli Định nghĩa Coliform mới - Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, lên men lactose sinh acid và gas (24-48h/36±2°C) - Fecal coliform : có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C; bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli thủy phân tryptophan tạo thành Indol) Coliforms được coi là VSV chỉ điểm vệ sinh Enzyme based methods Escherichia coli Klebsiella Enterobacter Citrobacter Yersinia Serratia Hafnia Pantoea • Kluyvera • Cedecea • Ewingella • Moellerella • Leclercia • Canella • Yokenella Escherichia coli Klebsiella •Enterobacter • Citrobacter • Yersinia • Serratia • Hafnia Pantoea Kluyvera Acid production from lactose Escherichia coli • Klebsiella • Enterobacter • Citrobacter Old defnition duction from lactose (Old defnition) Coliforms – Nơi cư trú và phát triển Nhóm coliform bao gồm cả VSV sống tự do và trong đường ruột động vật Fecal coliform chỉ phát triển ở đường ruột động vật máu nóng •E. coli chỉ phát triển ở đường ruột động vật. Khái niệm chung - Trực khuẩn Gram âm - Không sinh bào tử - Kỵ khí không bắt buộc - Lên men Lactose Vai trò - Chỉ điểm sự nhiễm phân - Đánh giá tình trạng vệ sinh nước và vệ sinh môi trường Nguyên lý phương pháp - Định lượng vi sinh vật lên men lactose có sinh khí khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30°C và phù hợp trong phép thử khẳng định Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Tài liệu trích dẫn: TCVN 4882 : 2001 Dụng cụ - Thiết bị - Máy đồng nhất mẫu - Tủ sấy 180 – 200°C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 30 ±1°C - Đĩa petri đường kính 90 – 100mm - Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1 và 10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1°C - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met, chính xác tới 0,1 đơn vị pH ở 25°C - Ống Durham Môi trường - Dung dịch pepton – muối - Canh thang Tryptose Lauryl sulfat ( Môi trường tăng sinh chọn lọc) - Canh thang mật lactose lục sáng (Lactose Bile Brilliant Green Broth – môi trường thử khẳng định) Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: - Sản phẩm dạng đặc: Cân 10g mẫu thử đã đồng nhất cho vào 90 ml dung dịch pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu (10-1). Từ đó pha loãng các đậ