Các phương pháp tạo ADN tái tổ hợp

Các phương pháp tạo ADN tái tổ hợp Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau. 1. Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch - Chọn và xử lí DNA plasmid: Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau. - Chọn và xử lí đoạn cài: DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng nghiên cứu. Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau. - Tạo plasmid tái tổ hợp: Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp. Phản ứng nối xảy ra theo sơ đồ được biểu diễn trên hình. 2. Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker) - Chọn và xử lí vector plasmid: (tương tự như trên) - Chọn và xử lí đoạn cài: Linker là những đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, sao cho ở giữa mỗi linker phải có trình tự nhận biết bởi một enzyme cắt hạn chế loại II. Ví dụ như EcoRI có chuỗi đích là G/AATTC. cDNA đầu bằng được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1. Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi được nhận biết bởi enzyme EcoRI. Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai. Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai đầu lệch. Phương pháp dùng đầu lệch Dùng các đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp 3. Tạo vector tái tổ hợp: Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI. Nhờ tác dụng của enzyme DNA ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành. - Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử DNA. Cách tạo DNA tái tổ hợp bằng phương pháp này được tiến hành theo 4 bước sau: - Bước 1: Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI (G/GATCC). Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính. Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch nhau. - Bước 2: Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của DNA lạ. Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH) của plasmid hở. - Bước 3: Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu mút của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC---) sẽ bắt cặp với nhau. - Bước 4: Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung. Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI. Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng.