Cấy chuyền nuôi cấy thứ cấp tạo dòng tế bào động vật

CẤY CHUYỀN NUÔI CẤY THỨ CẤP TẠO DÒNG Tế bào động vật dttloan@hcmus.edu.vn CẤY CHUYỀN & NUÔI CẤY THỨ CẤP - Tách TB khỏi môi trường cũ, xác định lại mật độ TB, tái nuôi cấy. - Sự phù hợp giữa mật độ TB – diện tích/không gian nuôi TB – thể tích môi trường tối ưu  TB tăng sinh tốt. - Sự hợp dòng - Kìm hãm tiếp xúc - Passage - Chu kì TB – thời gian nhân đôi American Type Culture Collection . HỢP DÒNG (CONFLUENCY) • TB PHỦ KÍN BỀ MẶT NUÔI CẤY • MẬT ĐỘ TẾ BÀO TỐI ƯU ĐỂ CẤY CHUYỀN ~80% • QUÁ ÍT, TB RƠI VÀO PHA LAG VÀ KHÔNG TĂNG SINH. • QUÁ NHIỀU: TB NGỪNG PHÂN CHIA HOẶC CHỒNG LẤP LÊN NHAU VÀ HÌNH THÀNH CỤM TB GIỐNG KHỐI U. KÌM HÃM TIẾP XÚC • KHI TB TIẾP XÚC VỚI NHAU  NGỪNG TĂNG TRƯỞNG • TB DỪNG Ở PHA G0 CỦA CHU KÌ TẾ BÀO (CELL CYCLE) • THỜI GIAN NHÂN ĐÔI: DOUBLING-TIME • HOẶC CÁC TB BỊ BIẾN ĐỔI CÓ THỂ TIẾP TỤC TĂNG SINH VÀ CHỒNG LẤP LÊN NHAU • PHÁT TRIỂN QUÁ MỨC RỒI CHẾT PASSAGE • TB ĐƯỢC TÁCH LÊN BỀ MẶT PLASTIC VÀ CẤY (SEED) TRỞ LẠI. • KÍ HIỆU: P# (SỐ PASSAGE). CLIP 3: CẤY CHUYỀN, NUÔI CẤY THỨ CẤP TẠO DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT • CELL LINE • CELL STRAIN • CELL CLONE • CELL LINEAGE • CONTINOUS CELL LINE • IMMORTAL CELL LINE • TRANSFORMED CELL LINE • FINITE/INFINITE CELL LINE • GENOTYPE • GENE EXPRESSION • PHENOTYPE • MICRO/TISSUE ENVIRONMENT GENERATION NUMBER PASSAGE NUMBER DOUBLING TIME CELL CYCLE Hela_Henrietta Lacks PHÂN LẬP CÁC DÒNG TẾ BÀO Cấy chuyền Cấy chuyền Cấy chuyền liên tục Mô Nuôi cấy tb đơn hay nuôi cấy mô in vitro Nuôi cấy sơ cấp Nuôi cấy thứ cấp Dòng tb Cell Line Phân lập từng tb đơn Tạo dòng tb Sự già yếu của tb Sự bất tử của tb Dòng tế bào bị biến đổi Dòng tb bất tử Mất kiểm soát tăng trưởng tb CELL LINE Các tế bào trong cùng một mô, cùng cơ quan được nuôi cấy gọi là dòng tế bào (?). Nuôi cấy sơ cấp -> cấy chuyền, khi đó những tế bào trong nuôi cấy đó được xem như là một dòng tế bào (?).  Một cell line có chứa các tế bào hoặc có kiểu hình tương tự nhau hoặc khác nhau. Các loại tế bào này có sự đồng nhất về kiểu gen hay không? Cell clone: subculture cell line: NCTC 1 tế bào từ cell line (in vitro). Cell clone Tất cả các tế bào trong một cell clone giống nhau hoàn toàn về kiểu hình và kiểu gen CELL CLONE TBG TỪ MÁU DÂY RỐN Cell clone????? Cell line?????? Marker TBG tạo máu TBG trung mô TBG sinh dưỡng không giới hạn TBG giống thể phôi Tế bào tiền thân đa tiềm năng CD34 + - - + - CD133 + * * + - CD14 * - - * + CD45 + - - - + CD44 + + + * + CD54 * + + * + CD73 - + * * - CD90 + + + * - CD105 - + + * + CD166 * + * * + PHƯƠNG PHÁP TẠO CELL LINE PHƯƠNG PHÁP TẠO CELL LINE Ficoll Sau khi thu nhận Sau 24 h Sau 72 hSau 7 ngày Sau 1 lần cấy chuyền PHƯƠNG PHÁP TẠO CELL LINE Phương pháp sử dụng ống syringe hay vòng nhẫn - Khi tế bào quan tâm được quan sát thấy trong đĩa nuôi, sử dụng vòng nhẫn để tách biệt chúng với các tế bào bên cạnh. Nguyên tắc - Tế bào quan tâm bị tách biệt không gian với các tế bào còn lại trong đĩa nuôi. Trong vòng nhẫn, một tế bào quan tâm ban đầu sẽ bắt đầu phân chia tạo thành một tập đoàn. - Thủy tinh, thép không rỉ, nhựa trung tính Phương pháp pha loãng tới hạn Nguyên tắc - Pha loãng huyền phù tế bào đến mức sao cho, nếu bổ sung một thể tích nhất định của huyền phù vào giếng nuôi thì mỗi giếng chỉ chứa tối đa là 1 tế bào (1 tế bào/giếng nuôi) (Counter-1 cell/200 µl) - Một tế bào trong một giếng sẽ phát triển thành một tập đoàn. - Quan sát, đánh giá để chọn lựa giếng chứa tập đoàn quan tâm - Nuôi tập đoàn đó tạo thành một cell clone PHƯƠNG PHÁP ROBOT HÓA PHƯƠNG PHÁP MARKER BỀ MẶT FLOW CYTOMETRY ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA THUỐC/ HÓA CHẤT MTT xCell Ligence