Nội
dung
• Chẩnđoán là gì ?!
• Phân biệt chẩnđoán và tiên lượng!
• Chẩnđoán phân tử!
• Phương pháp dùng trong chẩnđoán phân tử!
A. Phương pháp chẩnđoán miễn dịch!
B. Phương pháp chẩnđoán sử dụng nucleic acid
47 trang |
Chia sẻ: nguyenlinh90 | Lượt xem: 1138 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Chẩn đoán phân tử, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TS. Trần Hồng Diễm
PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc
Trường Đại học KHTN - Đại học Quốc Gia Tp. HCM
13/11/2015
CHẨN
ĐOÁN
PHÂN
TỬ
Nội
dung
!
• Chẩn đoán là gì ?!
• Phân biệt chẩn đoán và tiên lượng!
• Chẩn đoán phân tử!
• Phương pháp dùng trong chẩn đoán phân tử!
A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch!
'B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid!
Diagnosis
(Chẩn
đoán)
• là quá trình xác định bản chất hay nguyên nhân gây
bệnh từ những dấu hiệu hay triệu chứng, kể cả hoàn
cảnh người bệnh!
'diagnosis' chẩn đoán!
• dia means 'apart’!
• gignoskein means 'come to know’!
-> literally means 'recognizing’!
prognosis’ tiên lượng !
• pro means 'before’!
• gignoskein means 'come to know’ !
-> literally means 'foreknowing'!
Diagnosis
vs.
prognosis
Arthur Conan Doyle !
Sherlock Holmes!
Joseph Bell!
Chẩn
đoán
phân
tử
• Là kỹ thuật phân tích các marker sinh học trong genome và
proteome – mã hoá di truyền của 1 cá nhân và tế bào của người này
biểu hiện gen của họ qua các protein – bằng cách áp dụng sinh học
phân tử vào kiểm tra y học.!
• Kỹ thuật này được dùng để chẩn đoán và kiểm soát bệnh, phát hiện
nguy cơ và quyết định liệu pháp tốt nhất cho từng bệnh nhân!
SỬ DỤNG:!
• THÔNG TIN trình tự chuyên biệt !
trong!
• ĐẠI PHÂN TỬ !
cho!
• Phát hiện nguy cơ!
• Chẩn đoán!
• Tiên lượng!
• Dự đoán đáp ứng với liệu pháp điều trị!
• Kiểm soát đáp ứng điều trị!
Chẩn
đoán
phân
tử
(8)
ĐẠI
PHÂN
TỬ
• Peptide/protein!
• Polysaccharide !
• Polynucleotide /nucleic acid!
Myoglobin
Cellulose
Nucleic
acid
Pre-natal testing
Disease predisposition
Disease detection
Drug selection
Recurrence monitoring
Key questions
-> Need for Molecular tests
“Is the baby
healthy? “
“What diseases
is this patient at
risk for?”
“Does this
patient have a
disease?”
“What drugs
should I
prescribe?”
“Has the disease
returned?”
Hàng năm, Mỹ
chi trả cho
genetic testing và
Molecular
diagnostics từ
$3-4 billion
(thống kê
2006-2009)
Chẩn
đoán
phân
tử
(8)
18
s In the final scenario, we assumed that significant changes occur in testing technologies and that
there would be a much higher rate of adoption for both cancer and non-cancer tests to both
identify diseases and manage treatment courses. All but the last scenario assume that the infectious
disease market is relatively mature and do not expect substantial growth over the next 10 years.
Based on these scenarios, we project spending on genetic testing and molecular diagnostics will reach
between $15 billion and $25 billion by 2021 as shown in Figure 2.4:
Illustrative growth scenarios for molecular diagnostic and genetic testing spending, 2010 – 2021
$0
$5
$10
$15
$20
$25
$30
2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021
High
Medium
LowBi
lli
on
s
of
D
ol
la
rs
Figure 2.4; Source: UnitedHealth Center for Health Reform & Modernization, 2012
Finally, it is worth noting that although spending on genetic testing and molecular diagnostics is
relevant in its own right, the more important question is what broader effects the use of such tests
may have on the quality and costs of health care — particularly since, according to one estimate,
clinical laboratory tests influence about 70 percent of health care decisions.34 While history suggests
medical advances have often contributed to higher overall spending by making more complex and
costly tests and treatments available, they also have the potential to improve health outcomes and
the appropriateness of care — for example, by fostering the more targeted use of therapies for those
patients who will benefit most from them.35
We, therefore, now turn to the question of how consumers and their physicians think about the promise
of new genetic science and their views on what the future might hold.
Biểu đồ mô tả dự đoán chi phí cho chẩn đoán phân tử và các kiểm
tra di truyền ngày càng tăng, 2010-2021
Source: UnitedHealth Center for Health Reform & Modernization, 2012!
Đặc điểm của hệ thống phát hiện !
• Một hệ thống tốt có 3 đặc điểm !
– Nhạy!
– Đặc hiệu!
– Chuyên biệt!
• Nhạy: tất cả các test có thể phát hiện 1 lượng rất nhỏ mục tiêu
thậm chí trong sự hiện diện của các phân tử khác !
• Đặc hiệu: test cho ra 1 kết quả dương tính với phân tử mục tiêu
duy nhất
• Đơn giản: test có thể tiến hành 1 cách hiệu quả và ít tốn kém trên
1 quy trình cơ bản!
Chẩn
đoán
phân
tử
(8)
A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch
Chẩn
đoán
phân
tử
(8)
B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid
A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch
1. Radioimmunoassay!
2. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)!
3. Western Blotting!
4. Immunoprecipitation!
5. Immunofluorescence!
6. Flow Cytometry and Fluorescence!
7. Alternatives to Antigen-Antibody Reactions!
8. Immunoelectron Microscopy!
Phân
tử
mục
?êu
được
phát
hiện
bởi
kháng
thể
đơn
dòng
• Polypeptide hormones (chorionic gonadotropin, growth
hormone)!
• Tumor markers (Prostate-specific antigen) !
• Cytokines (interleukins 1-8)!
• Drug monitoring (cyclosporin)!
• Miscellaneous targets (Vitamin B12)!
• Infectious diseases (Chlamydia, Herpes, Rubella,
Hepatitis B, Legionella, HIV)!
1.
Miễn
dịch
phóng
xạ
(Radioimmunoassay)
• là 1 kỹ thuật rất nhạy để đo nồng độ kháng nguyên bằng việc
sử dụng kháng thể!
• Trong kỹ thuật này:!
Ø 1 lượng đã biết kháng nguyên được gắn phóng xạ (thường là
đồng vị phóng xạ gamma của iodine vào tyrosine) !
Ø trộn với 1 lượng đã biết kháng thể gắn kháng nguyên đó!
Ø thêm kháng nguyên ‘lạnh’ vào (không đánh dấu)!
Ø đo lượng kháng nguyên thay thế bởi kháng nguyên ‘lạnh’ sau
phản ứng cạnh tranh!
15 Ag + Ag* + Ab ! AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab*
Miễn
dịch
phóng
xạ
-‐
Nguyên
lí
• Sử dụng phản ứng miễn dịch [Antigen – Antibody reaction] để phân
tích 1 cơ chất!
!
Ag + Ag* + Ab ! AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab*
[Ag : kháng nguyên ‘lạnh’ ; Ag* kháng nguyên được đánh dấu phóng xạ]!
– Ag* và Ag không gắn với Ab được rửa !
– Sau bước rửa, hoạt tính phóng xạ của phức hợp gắn được đo!
– Nồng độ kháng nguyên ‘lạnh’ tương quan tỉ lệ nghịch với hoạt tính!
phóng xạ (HTPX) !
!
!
Ví dụ:!
Ứng với [Ag*Ab] ban đầu biết trước đo HTPX là 5000, nếu:!
- mẫu bệnh phẩm có Ag cần phát hiện (‘kháng nguyên lạnh) -> cạnh tranh với Ag* hình thành
phức hợp AgAb, như vậy nồng độ phức hợp gắn Ag*Ab sẽ giảm -> đo HTPX Ag*Ab ~ 2000!
- mẫu bệnh phẩm không chứa Ag cần phát hiện -> không có chất cạnh tranh với Ag* -> HTPX
Ag*Ab đo được vẫn ~ 5000!
Quy
trình
cơ
bản
của
PP
miễn
dịch
phóng
xạ
• Trong chẩn đoán dị ứng, 1 phương pháp miễn dịch phóng xạ
gọi là RAST test (radioallergosorbent test) được dùng để phát
hiện chất gây dị ứng!
Khác
với
Skin
test
Patch
test
mg/cm2 mg/patch
1 Niken sunfat 0.2 0.16
2 Wool alcohols 1 0.81
3 Neomycin sulphate 0.23 0.19
4 Kali dicromat 0.0023 0.019
5 Hỗn hợp caine 0.63 0.51
6 Hương thơm hỗn hợp 0.43 0.35
7 Nhựa thông 0.85 0.69
8 Nhựa epoxy 0.05 0.041
9 Hỗn hợp Quinoline 0,19 0,154
10 Nhựa thơm Peru 0,80 0,65
11 Ethylenediaminedihyrocloride 0,050 0,041
12 Cobalt chloride 0,020 0,016
13 P-tertButylphenolformaldehyderesin 0,050 0,041
14 Hỗn hợp Paraben 1,0 0,80
15 Hỗn hợp Carba 0,25 0,20
16 Hỗn hợp cao su đen 0,075 0,060
17 Cl+Me-Isothiazolinene (Kathon CG) 0,0040 0,0032
18 Quaternium-15 0,10 0,081
19 Mercaptobenzothiazole 0,075 0,061
20 P-Phenylenediamine 0,090 0,073
21 Formaldehyde 0,18 0,15
22 Mercapto hỗn hợp 0,075 0,060
23 Thimerosal 0,0080 0,0065
24 Thiuram hỗn hợp 0,025 0,020
25 Diazolidinyl urea (Germall II) 0,55 0,45
26 Imidazolidinyl urea (Germal 115) 0,60 0,49
27 Budesonide 0,0010 0,00081
28 TixocortolPivalate 0,0030 0,0024
29 Hydrocortisone-17-butyrate 0,020 0,016
Vd:
1
miếng
T.R.U.E
PATCH
có
thể
phát
hiện
29
chất
gây
dị
ứng
khác
nhau
'Ưu điểm
• Thuận tiện !
• Nhanh (thường ≤ 2 ngày)!
• Nhạy (phát hiện chất < ng/ml)!
• Thực hiện với số lượng mẫu lớn ( ngàn mẫu /ngày)!
• Đặc hiệu!
'Nhược điểm
• Dùng chất đồng vị phóng xạ!
• Tốn kém!
Miễn
dịch
phóng
xạ
(8)
2.
Enzyme
linked
immunosorbent
assay
(ELISA)
• Phương pháp miễn dịch định lượng trong đó phản ứng
Ag- Ab được phân tích dựa vào đo hoạt tính enzyme!
• ELISA test, là kiểm tra sàng lọc đầu tiên sử dụng phổ
biến cho HIV!
• Có độ nhạy cao !
22
Tại
sao
là
......?
Enzyme
Linked
Immunosorbent
Assay
1. Antigen of interest is absorbed on to plastic surface (‘sorbent’)!
2. Antigen is recognised by specific antibody (‘immuno’)!
3. This antibody is recognised by second antibody (‘immuno’)
which has enzyme attached (‘enzyme-linked’)!
4. Substrate reacts with enzyme to produce product, usually
coloured. !
23
ELISA-‐Nguyên
lí
• Sử dụng 1 enzyme để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa
Ag và Ab!
• Enzyme sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm
có màu -> cho thấy sự hiện diện của mối gắn kết Ag-Ab!
• Có thể dùng để phát hiện sự hiện diện của kháng
nguyên hoặc kháng thể, tuỳ vào cách thiết kế xét
nghiệm!
24
Substrate
Primary
antibody
Enzym
e
Secondary
antibody
Different antigens in sample
Coloured
product
25
26
Quy
trình
cơ
bản
của
ELISA
Enzymes
dùng
trong
ELISA
• Horseradish peroxidase (được dùng phổ biến nhất)!
• Alkaline Phosphatase!
• β-galactosidase!
• Lactoperoxidase!
• Tetra Methyl benzidine!
27
Comparison between Indirect Sandwich & Competitive ELISA
to detect Ab (HIV, HCV)
to detect Ag ( Tumor Markers, Hormones )
to detect Ag ( Free Testosterone)
28
'
Ưu điểm
• Cho độ nhạy và đặc hiệu cao!
• Nhanh chóng!
• Không sử dụng chất phóng xạ độc hai!
• Có thể dùng rộng rãi trong nhiều phân tích khác nhau
!
29
ELISA
(8)
ELISA
(8)
'Nhược điểm
• Cần phải có kháng thể đặc hiệu -> tốn kém!
• Rất đặc hiệu cho 1 kháng nguyên cụ thể, sẽ không phát
hiện được kháng nguyên nào khác !
• Hoạt tính enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi thành phần
huyết tương -> kết quả có thể không chính xác tuyệt đối!
• có thể cho kết quả dương tính giả / âm tính giả , đặc biệt
trong trường hợp kháng nguyên bị đột biến/ biến đổi !
• Phát hiện kháng thể kháng Mycobacterium trong bệnh lao!
• Phát hiện rotavirus trong phân!
• Phát hiện marker viêm gan B trong huyết thanh!
• Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu!
• Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để phát hiện chất
có tiềm năng gây dị ứng trong thực phẩm (trứng, sữa, đậu
phụng, hạt hạnh nhân,)!
ELISA
-‐
Ứng
dụng
B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic
acid
1. PCR!
2. Real-Time PCR!
3. Isothermal amplification!
4. Hybridization!
5. Sequencing!
phổ biến!
• Trong đó DNA được khuyếch đại để phát hiện sự hiện diện của yếu
tố gây bệnh hoặc gen quan tâm!
'Ưu điểm
• Nhanh!
'Nhược điểm
• Độ đặc hiệu kém !
• Độ nhạy thấp !
• Độ phân giải kém, chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR!
• Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm !
• Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư )!
1.
Polymerase
chain
reac?on
(PCR)
PCR
-‐
Ứng
dụng
Phát hiện tác nhân VSV gây bệnh
• Tác nhân không thể nuôi cấy thường qui!
• Tác nhân virus (HBV, HCV, SXH)!
• Tác nhân vi khuẩn (Chlamydia, Legionella,)!
• Tác nhân VK nuôi cấy chậm ( M. tuberculosis)!
• Tác nhân VK nuôi cấy thất bại (SL ít, hay đã bị điều trị
kháng sinh trước đó) !
• là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực
tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt!
• Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản
ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ
nhiệt - Real time)!
• Phát hiện và định lượng nồng độ sản phâ ̉m sau mô ̃i chu kỳ nhiệt
dựa trên cường độ phát huỳnh quang. !
2.
Real-‐Time
PCR
Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh
quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm
PCR > tín hiệu nền.
- Ct (Threshold cycle):
là số chu kỳ mà tại đó
tín hiệu huỳnh quang
của sản phẩm khuếch
đại vượt qua ngưỡng.
-Động học RealtimePCR
Phân tích tiến trình phản
ứng trong mỗi chu kỳ
nhiệt nhờ computer
THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU Thời
điểm
phát
hiện
ln
hiệu
iCycler from BioRad!
Cycler!
Real-Time Detection !
Máy
Real-‐Time
PCR
1. Đèn
Halogen-
tungsten!
2a. Kính lọc
kích thích!
2b. Kính lọc phát sáng!
4. Đĩa mẫu!
3. Bộ phận
khuyếch đại! 5. CCD phát hiện
350,000
pixels!
1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 102 103 104 105 106
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
Cycle 13
Cycle 11
1 10 102 103 104 105 106
C.41
C.39
C.36
C.33
C.31
C.29
C.34
Mẫu chưa biết [C]
Standard curve
Cy
cle
nu
mb
er
DNA concentration (copies/ml)
Real-‐Time
PCR
Seang
Thresholds
• Một khi threshold (ngưỡng) được
thiết lập, các giá trị Ct được tính tự
động nhờ phần mềm!
• Giá trị Ct sau đó được dùng để tính toán lượng DNA
Ưu điểm
• Đơn giản, nhanh chóng, dễ phân tích kết quả !
• Tránh được ngoại nhiễm vì không cần phân tích sau PCR!
• Có thể định lượng trong phạm vi lớn !
• Độ nhạy cao hơn so với PCR !
• Độ đặc hiệu cao hơn so với PCR !
• Thích hợp cho lâm sàng!
Real-‐Time
PCR
(8)
• Giúp phát hiện tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm!
(vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm)!
• Giúp định lượng tác nhân gây bênh trong mẫu bệnh phẩm!
• Theo dõi điều tri ̣
Vd: Xác định số lượng virus (HIV, HBV, HCV...)!
• Tiên đoán mư ́c độ nghiêm trọng và tiên đoán kết quả
Vd: Xác định số lượng khởi đầu của các tác nhân gây bệnh khẩn cấp
trong mẫu bệnh (sốt xuất huyết, H5N1, H1N1..)!
• Ứng dụng trong ung thư học lâm sàng
- Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư !
- So sánh kết quả định lượng trước và sau điê ̀u trị giúp đánh giá
mức độ tồn lưu ác tính của bệnh.!
Real-‐Time
PCR
-‐
Ứng
dụng
(8)