Chẩn đoán phân tử

TS. Trần Hồng Diễm PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc Trường Đại học KHTN - Đại học Quốc Gia Tp. HCM 13/11/2015   CHẨN  ĐOÁN  PHÂN  TỬ     Nội  dung   ! •  Chẩn đoán là gì ?! •  Phân biệt chẩn đoán và tiên lượng! •  Chẩn đoán phân tử! •  Phương pháp dùng trong chẩn đoán phân tử! A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch! 'B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid! Diagnosis  (Chẩn  đoán)   •  là quá trình xác định bản chất hay nguyên nhân gây bệnh từ những dấu hiệu hay triệu chứng, kể cả hoàn cảnh người bệnh! 'diagnosis' chẩn đoán! •  dia means 'apart’! •  gignoskein means 'come to know’! -> literally means 'recognizing’! prognosis’ tiên lượng ! •  pro means 'before’! •  gignoskein means 'come to know’ ! -> literally means 'foreknowing'! Diagnosis  vs.  prognosis   Arthur Conan Doyle ! Sherlock Holmes! Joseph Bell! Chẩn  đoán  phân  tử     •  Là kỹ thuật phân tích các marker sinh học trong genome và proteome – mã hoá di truyền của 1 cá nhân và tế bào của người này biểu hiện gen của họ qua các protein – bằng cách áp dụng sinh học phân tử vào kiểm tra y học.! •  Kỹ thuật này được dùng để chẩn đoán và kiểm soát bệnh, phát hiện nguy cơ và quyết định liệu pháp tốt nhất cho từng bệnh nhân! SỬ DỤNG:! •  THÔNG TIN trình tự chuyên biệt ! trong! •  ĐẠI PHÂN TỬ ! cho! •  Phát hiện nguy cơ! •  Chẩn đoán! •  Tiên lượng! •  Dự đoán đáp ứng với liệu pháp điều trị! •  Kiểm soát đáp ứng điều trị! Chẩn  đoán  phân  tử  (8)   ĐẠI  PHÂN  TỬ   •  Peptide/protein! •  Polysaccharide ! •  Polynucleotide /nucleic acid! Myoglobin   Cellulose   Nucleic  acid   Pre-natal testing Disease predisposition Disease detection Drug selection Recurrence monitoring Key questions -> Need for Molecular tests “Is the baby healthy? “ “What diseases is this patient at risk for?” “Does this patient have a disease?” “What drugs should I prescribe?” “Has the disease returned?” Hàng năm, Mỹ chi trả cho genetic testing và Molecular diagnostics từ $3-4 billion (thống kê 2006-2009) Chẩn  đoán  phân  tử  (8)   18 s In the final scenario, we assumed that significant changes occur in testing technologies and that there would be a much higher rate of adoption for both cancer and non-cancer tests to both identify diseases and manage treatment courses. All but the last scenario assume that the infectious disease market is relatively mature and do not expect substantial growth over the next 10 years. Based on these scenarios, we project spending on genetic testing and molecular diagnostics will reach between $15 billion and $25 billion by 2021 as shown in Figure 2.4: Illustrative growth scenarios for molecular diagnostic and genetic testing spending, 2010 – 2021 $0 $5 $10 $15 $20 $25 $30 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 High Medium LowBi lli on s of D ol la rs Figure 2.4; Source: UnitedHealth Center for Health Reform & Modernization, 2012 Finally, it is worth noting that although spending on genetic testing and molecular diagnostics is relevant in its own right, the more important question is what broader effects the use of such tests may have on the quality and costs of health care — particularly since, according to one estimate, clinical laboratory tests influence about 70 percent of health care decisions.34 While history suggests medical advances have often contributed to higher overall spending by making more complex and costly tests and treatments available, they also have the potential to improve health outcomes and the appropriateness of care — for example, by fostering the more targeted use of therapies for those patients who will benefit most from them.35 We, therefore, now turn to the question of how consumers and their physicians think about the promise of new genetic science and their views on what the future might hold. Biểu đồ mô tả dự đoán chi phí cho chẩn đoán phân tử và các kiểm tra di truyền ngày càng tăng, 2010-2021 Source: UnitedHealth Center for Health Reform & Modernization, 2012! Đặc điểm của hệ thống phát hiện ! •  Một hệ thống tốt có 3 đặc điểm ! –  Nhạy! –  Đặc hiệu! –  Chuyên biệt! •  Nhạy: tất cả các test có thể phát hiện 1 lượng rất nhỏ mục tiêu thậm chí trong sự hiện diện của các phân tử khác ! •  Đặc hiệu: test cho ra 1 kết quả dương tính với phân tử mục tiêu duy nhất •  Đơn giản: test có thể tiến hành 1 cách hiệu quả và ít tốn kém trên 1 quy trình cơ bản! Chẩn  đoán  phân  tử  (8)     A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch Chẩn  đoán  phân  tử  (8)     B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch 1.  Radioimmunoassay! 2.  Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)! 3.  Western Blotting! 4.  Immunoprecipitation! 5.  Immunofluorescence! 6.  Flow Cytometry and Fluorescence! 7.  Alternatives to Antigen-Antibody Reactions! 8.  Immunoelectron Microscopy! Phân  tử  mục  ?êu  được  phát  hiện  bởi  kháng  thể   đơn  dòng   •  Polypeptide hormones (chorionic gonadotropin, growth hormone)! •  Tumor markers (Prostate-specific antigen) ! •  Cytokines (interleukins 1-8)! •  Drug monitoring (cyclosporin)! •  Miscellaneous targets (Vitamin B12)! •  Infectious diseases (Chlamydia, Herpes, Rubella, Hepatitis B, Legionella, HIV)! 1.  Miễn  dịch  phóng  xạ  (Radioimmunoassay)   •  là 1 kỹ thuật rất nhạy để đo nồng độ kháng nguyên bằng việc sử dụng kháng thể! •  Trong kỹ thuật này:! Ø  1 lượng đã biết kháng nguyên được gắn phóng xạ (thường là đồng vị phóng xạ gamma của iodine vào tyrosine) ! Ø  trộn với 1 lượng đã biết kháng thể gắn kháng nguyên đó! Ø  thêm kháng nguyên ‘lạnh’ vào (không đánh dấu)! Ø  đo lượng kháng nguyên thay thế bởi kháng nguyên ‘lạnh’ sau phản ứng cạnh tranh! 15 Ag + Ag* + Ab ! AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab* Miễn  dịch  phóng  xạ  -­‐  Nguyên  lí   •  Sử dụng phản ứng miễn dịch [Antigen – Antibody reaction] để phân tích 1 cơ chất! ! Ag + Ag* + Ab ! AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab* [Ag : kháng nguyên ‘lạnh’ ; Ag* kháng nguyên được đánh dấu phóng xạ]! –  Ag* và Ag không gắn với Ab được rửa ! –  Sau bước rửa, hoạt tính phóng xạ của phức hợp gắn được đo! –  Nồng độ kháng nguyên ‘lạnh’ tương quan tỉ lệ nghịch với hoạt tính! phóng xạ (HTPX) ! ! ! Ví dụ:! Ứng với [Ag*Ab] ban đầu biết trước đo HTPX là 5000, nếu:! - mẫu bệnh phẩm có Ag cần phát hiện (‘kháng nguyên lạnh) -> cạnh tranh với Ag* hình thành phức hợp AgAb, như vậy nồng độ phức hợp gắn Ag*Ab sẽ giảm -> đo HTPX Ag*Ab ~ 2000! - mẫu bệnh phẩm không chứa Ag cần phát hiện -> không có chất cạnh tranh với Ag* -> HTPX Ag*Ab đo được vẫn ~ 5000! Quy  trình  cơ  bản  của  PP  miễn  dịch  phóng  xạ   •  Trong chẩn đoán dị ứng, 1 phương pháp miễn dịch phóng xạ gọi là RAST test (radioallergosorbent test) được dùng để phát hiện chất gây dị ứng! Khác  với   Skin  test   Patch  test   mg/cm2 mg/patch 1 Niken sunfat 0.2 0.16 2 Wool alcohols 1 0.81 3 Neomycin sulphate 0.23 0.19 4 Kali dicromat 0.0023 0.019 5 Hỗn hợp caine 0.63 0.51 6 Hương thơm hỗn hợp 0.43 0.35 7 Nhựa thông 0.85 0.69 8 Nhựa epoxy 0.05 0.041 9 Hỗn hợp Quinoline 0,19 0,154 10 Nhựa thơm Peru 0,80 0,65 11 Ethylenediaminedihyrocloride 0,050 0,041 12 Cobalt chloride 0,020 0,016 13 P-tertButylphenolformaldehyderesin 0,050 0,041 14 Hỗn hợp Paraben 1,0 0,80 15 Hỗn hợp Carba 0,25 0,20 16 Hỗn hợp cao su đen 0,075 0,060 17 Cl+Me-Isothiazolinene (Kathon CG) 0,0040 0,0032 18 Quaternium-15 0,10 0,081 19 Mercaptobenzothiazole 0,075 0,061 20 P-Phenylenediamine 0,090 0,073 21 Formaldehyde 0,18 0,15 22 Mercapto hỗn hợp 0,075 0,060 23 Thimerosal 0,0080 0,0065 24 Thiuram hỗn hợp 0,025 0,020 25 Diazolidinyl urea (Germall II) 0,55 0,45 26 Imidazolidinyl urea (Germal 115) 0,60 0,49 27 Budesonide 0,0010 0,00081 28 TixocortolPivalate 0,0030 0,0024 29 Hydrocortisone-17-butyrate 0,020 0,016 Vd:  1  miếng  T.R.U.E  PATCH  có  thể  phát  hiện  29  chất  gây  dị  ứng  khác  nhau     'Ưu điểm •  Thuận tiện ! •  Nhanh (thường ≤ 2 ngày)! •  Nhạy (phát hiện chất < ng/ml)! •  Thực hiện với số lượng mẫu lớn ( ngàn mẫu /ngày)! •  Đặc hiệu! 'Nhược điểm •  Dùng chất đồng vị phóng xạ! •  Tốn kém! Miễn  dịch  phóng  xạ  (8)     2.  Enzyme  linked  immunosorbent  assay   (ELISA)     •  Phương pháp miễn dịch định lượng trong đó phản ứng Ag- Ab được phân tích dựa vào đo hoạt tính enzyme! •  ELISA test, là kiểm tra sàng lọc đầu tiên sử dụng phổ biến cho HIV! •  Có độ nhạy cao ! 22 Tại  sao  là  ......?    Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay   1. Antigen of interest is absorbed on to plastic surface (‘sorbent’)! 2. Antigen is recognised by specific antibody (‘immuno’)! 3. This antibody is recognised by second antibody (‘immuno’) which has enzyme attached (‘enzyme-linked’)! 4. Substrate reacts with enzyme to produce product, usually coloured. ! 23 ELISA-­‐Nguyên  lí   •  Sử dụng 1 enzyme để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa Ag và Ab! •  Enzyme sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có màu -> cho thấy sự hiện diện của mối gắn kết Ag-Ab! •  Có thể dùng để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên hoặc kháng thể, tuỳ vào cách thiết kế xét nghiệm! 24 Substrate   Primary antibody Enzym e   Secondary antibody Different antigens in sample Coloured product 25 26 Quy  trình  cơ  bản  của  ELISA   Enzymes  dùng  trong  ELISA   •  Horseradish peroxidase (được dùng phổ biến nhất)! •  Alkaline Phosphatase! •  β-galactosidase! •  Lactoperoxidase! •  Tetra Methyl benzidine! 27 Comparison between Indirect Sandwich & Competitive ELISA to detect Ab (HIV, HCV) to detect Ag ( Tumor Markers, Hormones ) to detect Ag ( Free Testosterone) 28  ' Ưu điểm •  Cho độ nhạy và đặc hiệu cao! •  Nhanh chóng! •  Không sử dụng chất phóng xạ độc hai! •  Có thể dùng rộng rãi trong nhiều phân tích khác nhau ! 29 ELISA  (8)   ELISA  (8)   'Nhược điểm •  Cần phải có kháng thể đặc hiệu -> tốn kém! •  Rất đặc hiệu cho 1 kháng nguyên cụ thể, sẽ không phát hiện được kháng nguyên nào khác ! •  Hoạt tính enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi thành phần huyết tương -> kết quả có thể không chính xác tuyệt đối! •  có thể cho kết quả dương tính giả / âm tính giả , đặc biệt trong trường hợp kháng nguyên bị đột biến/ biến đổi ! •  Phát hiện kháng thể kháng Mycobacterium trong bệnh lao! •  Phát hiện rotavirus trong phân! •  Phát hiện marker viêm gan B trong huyết thanh! •  Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu! •  Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để phát hiện chất có tiềm năng gây dị ứng trong thực phẩm (trứng, sữa, đậu phụng, hạt hạnh nhân,)! ELISA  -­‐  Ứng  dụng   B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid 1.  PCR! 2.  Real-Time PCR! 3.  Isothermal amplification! 4.  Hybridization! 5.  Sequencing! phổ biến! •  Trong đó DNA được khuyếch đại để phát hiện sự hiện diện của yếu tố gây bệnh hoặc gen quan tâm! 'Ưu điểm •  Nhanh! 'Nhược điểm •  Độ đặc hiệu kém ! •  Độ nhạy thấp ! •  Độ phân giải kém, chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR! •  Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm ! •  Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư )! 1.  Polymerase  chain  reac?on  (PCR)   PCR  -­‐  Ứng  dụng     Phát hiện tác nhân VSV gây bệnh •  Tác nhân không thể nuôi cấy thường qui! •  Tác nhân virus (HBV, HCV, SXH)! •  Tác nhân vi khuẩn (Chlamydia, Legionella,)! •  Tác nhân VK nuôi cấy chậm ( M. tuberculosis)! •  Tác nhân VK nuôi cấy thất bại (SL ít, hay đã bị điều trị kháng sinh trước đó) ! •  là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt! •  Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time)! •  Phát hiện và định lượng nồng độ sản phâ ̉m sau mô ̃i chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang. ! 2.  Real-­‐Time  PCR   Threshold: điểm  bắt  đầu  quan  sát  được  tín  hiệu  huỳnh   quang  phát  ra,  tại  thời  điểm  này  tín  hiệu  do  sản  phẩm   PCR  >  tín  hiệu  nền. - Ct (Threshold cycle): là  số  chu  kỳ  mà  tại  đó   tín  hiệu  huỳnh  quang   của  sản  phẩm  khuếch   đại  vượt  qua  ngưỡng. -Động  học  RealtimePCR Phân  tích  tiến  trình  phản ứng  trong  mỗi  chu  kỳ   nhiệt  nhờ  computer THỜI  ĐIỂM  PHÁT  HIỆN  TÍN  HIỆU Thời  điểm  phát  hiện  ln  hiệu   iCycler from BioRad! Cycler! Real-Time Detection ! Máy  Real-­‐Time  PCR   1. Đèn Halogen- tungsten! 2a. Kính lọc kích thích! 2b. Kính lọc phát sáng! 4. Đĩa mẫu! 3. Bộ phận khuyếch đại! 5. CCD phát hiện 350,000 pixels! 1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 102 103 104 105 106 C.41 C.39 C.36 C.33 C.31 C.29 C.34 Mẫu  chưa  biết  [C] Standard curve Cy cle nu mb er   DNA concentration (copies/ml) Real-­‐Time  PCR   Seang  Thresholds   •  Một khi threshold (ngưỡng) được thiết lập, các giá trị Ct được tính tự động nhờ phần mềm! • Giá trị Ct sau đó được dùng để tính toán lượng DNA Ưu điểm •  Đơn giản, nhanh chóng, dễ phân tích kết quả ! •  Tránh được ngoại nhiễm vì không cần phân tích sau PCR! •  Có thể định lượng trong phạm vi lớn ! •  Độ nhạy cao hơn so với PCR ! •  Độ đặc hiệu cao hơn so với PCR ! •  Thích hợp cho lâm sàng! Real-­‐Time  PCR  (8)   •  Giúp phát hiện tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm! (vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm)! •  Giúp định lượng tác nhân gây bênh trong mẫu bệnh phẩm! •  Theo dõi điều tri ̣ Vd: Xác định số lượng virus (HIV, HBV, HCV...)! •  Tiên đoán mư ́c độ nghiêm trọng và tiên đoán kết quả Vd: Xác định số lượng khởi đầu của các tác nhân gây bệnh khẩn cấp trong mẫu bệnh (sốt xuất huyết, H5N1, H1N1..)! •  Ứng dụng trong ung thư học lâm sàng -  Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư ! -  So sánh kết quả định lượng trước và sau điê ̀u trị giúp đánh giá mức độ tồn lưu ác tính của bệnh.! Real-­‐Time  PCR  -­‐  Ứng  dụng  (8)