Chế tạo và khảo sát hoạt tính kháng nấm của hạt đồng nano được ổn định bằng chitosan

TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, kim loại đồng có kích thước nanomet đã được tổng hợp bằng phương pháp hoá học sử dụng chitosan làm chất ổn định và NaBH4 làm chất khử. Sự hình thành hạt đồng nano được xác định bằng màu sắc đặc trưng và phổ UV-vis. Hình thái và kích thước hạt được xác định bằng phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Kết quả cho thấy khi với sự hiện diện của chitosan, các hạt đồng nano đã được chế tạo thành công với kích thước hạt khoảng 3,7 nm. Vật liệu thu được thể hiện hoạt tính kháng nấm tốt. Nấm mốc Aspergillus niger bị ức chế gần như hoàn toàn ở nồng độ đồng nano 50 ppm.

pdf8 trang | Chia sẻ: thanhle95 | Lượt xem: 386 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Chế tạo và khảo sát hoạt tính kháng nấm của hạt đồng nano được ổn định bằng chitosan, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN SAIGON UNIVERSITY TẠP CHÍ KHOA HỌC SCIENTIFIC JOURNAL ĐẠI HỌC SÀI GÒN OF SAIGON UNIVERSITY Số 71 (05/2020) No. 71 (05/2020) Email: tcdhsg@sgu.edu.vn ; Website: 34 CHẾ TẠO VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA HẠT ĐỒNG NANO ĐƯỢC ỔN ĐỊNH BẰNG CHITOSAN Copper nanoparticles stabilized by Chitosan: preparation and antifungal activity ThS. Phạm Thị Giang Anh(1), TS. Đặng Xuân Dự(2) (1),(2)Trường Đại học Sài Gòn TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, kim loại đồng có kích thước nanomet đã được tổng hợp bằng phương pháp hoá học sử dụng chitosan làm chất ổn định và NaBH4 làm chất khử. Sự hình thành hạt đồng nano được xác định bằng màu sắc đặc trưng và phổ UV-vis. Hình thái và kích thước hạt được xác định bằng phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Kết quả cho thấy khi với sự hiện diện của chitosan, các hạt đồng nano đã được chế tạo thành công với kích thước hạt khoảng 3,7 nm. Vật liệu thu được thể hiện hoạt tính kháng nấm tốt. Nấm mốc Aspergillus niger bị ức chế gần như hoàn toàn ở nồng độ đồng nano 50 ppm. Từ khóa: chất ổn định, chitosan, đồng nano, hoạt tính kháng nấm ABSTRACT In this present paper, copper nanoparticles were prepared by a chemical method using chitosan as a stabilizer and NaBH4 as a reducing agent. The formation of copper nanoparticles was confirmed by the characteristic of colour and UV-vis spectra. The morphology and particle size of the material were determined by transmission electron microscopy (TEM). The results showed that copper nanoparticles with a particle size of 3,7 nm were successfully prepared in the presence of chitosan. The as-prepared materials exhibited a good antifungal activity. The Aspergillus niger fungus was almost entirely inhibited by the copper nanoparticles at the concentration of 50 ppm. Keywords: stabilizer, chitosan, copper nanoparticles, antifungal activity 1. Mở đầu Chế tạo và nghiên cứu hoạt tính của các hạt nano kim loại với kích thước và hình dạng khác nhau nhằm khám phá các tính chất cũng như khả năng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau như y sinh [1], điện tử, quang học [2], và xúc tác [3], [4] là những hướng nghiên cứu hấp dẫn, thu hút được nhiều sự quan tâm trong thời gian gần đây. Vật liệu nano của các kim loại quý như bạc, vàng và bạch kim thường được ứng dụng khá hiệu quả trong các lĩnh vực nêu trên. Tuy vậy, do giá thành cao nên việc sản xuất chúng để ứng dụng rộng rãi với số lượng lớn là kém khả thi. Để giải quyết vấn đề đó, đồng nano được xem là lựa chọn tốt để thay thế do giá thành khá rẻ. Chế tạo đồng nano thường khó thu được hiệu suất cũng như độ tinh khiết cao Email: dangxuandu@sgu.edu.vn PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN 35 vì bề mặt dễ bị oxi hóa, sản phẩm dễ lẫn CuO và Cu2O. Để khắc phục hạn chế này, các chất chống oxy hoá thường được sử dụng cho quá trình chế tạo. Một số loại polymer cũng thường được sử dụng nhằm ổn định hệ hạt, tránh sự keo tụ và bảo vệ hạt khỏi bị oxy hoá. Những nghiên cứu đó đều hướng đến mục tiêu chung là tạo ra các hạt đồng nano có kích thước nhỏ với độ ổn định cao để khai thác tối đa các ứng dụng của chúng. Chitosan là một polymer tự nhiên được chế tạo bằng quá trình đề axetyl hóa chitin sử dụng kiềm đặc. Chitosan có ưu điểm nổi bật là phân hủy sinh học, không độc, có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa.v.v. [3]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy, chitosan có khả năng ổn định tốt các hạt nano và hạn chế quá trình oxy hóa [3]. Ngoài ra, loại polymer này tồn tại khá phong phú trong tự nhiên, dễ tách chiết ở điều kiện bình thường, vì vậy rất có triển vọng áp dụng ở quy mô lớn. Trong nghiên cứu này, đồng nano được chế tạo bằng cách khử ion Cu2+ với NaBH4 chất khử, chitosan làm chất ổn định, cơ chế ổn định các hạt đồng nano bằng chitosan cũng được thảo luận. Ngoài ra, sản phẩm tạo thành cũng được kiểm tra hoạt tính chống nấm ở các nồng độ khác nhau đối với chủng Aspergillus niger. 2. Thực nghiệm 2.1. Nguyên liệu và hóa chất Chitosan với khối lượng phân tử 90 kDa được cung cấp bởi công ty Cổ phần Đầu tư và Công nghệ Hương Nam, Bà Rịa - Vũng Tàu. NaBH4 là sản phẩm tinh khiết của Merck (Đức), CuSO4.5H2O dạng tinh khiết của Beijing (Trung Quốc). Các hóa chất khác như acid acetic, acid ascorbic được sử dụng ở dạng tinh khiết phân tích. Nước cất hai lần được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm. 2.2. Phương pháp thực nghiệm 2.2.1. Chế tạo đồng nano ổn định bằng chitosan Sơ đồ quy trình chế tạo đồng nano theo tài liệu [3], chỉ thay đổi khối lượng phân tử chitosan và nồng độ, được thể hiện trên Hình 1. Hòa tan 0,25 gam CuSO4.5H2O bằng nước cất thu được 40 mL dung dịch CuSO4 nồng độ 0,025M, thêm 100 mL acid acetic 0,1M chứa 1% chitosan theo khối lượng, khuấy hỗn hợp trên trong vòng 20 phút bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Cho 0,5 mL acid ascorbic 0,5M vào hỗn hợp phản ứng, tiếp tục khuấy từ trong 20 phút. Nhỏ 0,5 mL NaBH4 0,4M vào hỗn hợp, tiếp tục khuấy 5 phút, dung dịch chuyển sang màu nâu đen. Tiếp tục khuấy từ 30 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Dung dịch đồng nano hình thành được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ phòng, tránh tiếp xúc với không khí cho các nghiên cứu tiếp theo. SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No. 71 (05/2020) 36 Hình 1. Sơ đồ quy trình chế tạo đồng nano 2.2.2. Đặc trưng đồng nano Đồng nano sau khi chế tạo được đặc trưng bằng phương pháp phổ UV-vis trên thiết bị UV - DR 5000; phương pháp nhiễu xạ tia X, sử dụng thiết bị đo XRD với bức xạ CuKα (λ = 0,15406 nm), thế tăng tốc 40kV, 40mA, góc 2θ = 20° – 90°, tốc độ quét 0,03°/s. Hình thái và kích thước hạt được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) trên thiết bị JEM-1400. 2.2.3. Khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc Dung dịch keo đồng nano sau khi chế tạo, được khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc Aspergillus Niger theo các bước sau: a) Pha môi trường Môi trường Crapek (môi trường đối chứng): Thành phần gồm Sucrose 15g, NaNO3 1,5g, K2HPO4 0,5g, KCl 0,25g, FeSO4.7H2O 0,05g, MgSO4.7H2O 0,25g, Agar 15g. Cách pha: cân chính xác thành phần của môi trường, cho 200ml nước cất vào cốc thủy tinh, sau đó thêm lần lượt NaNO3, K2HPO4, KCl, FeSO4.7H2O, MgSO4.7H2O và sucrose vào cốc rồi khuấy từ cho tới khi tan hết. Tiếp đến, chuyển dung dịch vào bình định mức rồi thêm nước để thu được 500 mL dung dịch. Đổ dung dịch ra lại cốc thủy tinh rồi điều chỉnh pH = 6 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M, thêm agar và tiếp tục khuấy từ trong khoảng 10 phút. Cuối cùng, đổ môi trường vào 2 bình erlen dung tích 250 ml, đậy kín bằng bông và bọc bên ngoài bằng giấy để hấp vô trùng. Môi trường mẫu Thành phần và cách pha tương tự như môi trường đối chứng nhưng cho thêm đồng nano vào dung dịch sau khi chỉnh pH để được nồng độ đồng nano khoảng từ 20 ppm đến 100 ppm, đồng nano được thêm vào dưới dạng dung dịch, nồng độ được tính theo nồng độ ion Cu2+. b) Hấp dụng cụ, môi trường Dụng cụ và môi trường được hấp vô trùng ở 121ºC trong 30 phút sử dụng nồi hấp khử trùng Tomy Autoclave. Dụng cụ PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN 37 sau khi hấp vô trùng được sấy ở nhiệt độ 120ºC. c) Đổ môi trường Pha từ từ dung dịch môi trường mẫu có chứa đồng nano và môi trường đối chứng vào các đĩa petri đã hấp vô trùng. Giai đoạn này được tiến hành trong tủ cấy. d) Nuôi cấy Cấy nấm mốc Aspergillus Niger vào môi trường mẫu và môi trường đối chứng. Sau 5 ngày nuôi cấy, quan sát kết quả phát triển nấm mốc trên môi trường mẫu và môi trường đối chứng để đánh giá hiệu quả kháng nấm của dung dịch keo đồng nano. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Sự hình thành keo đồng nano Hình 2. Phổ UV-vis của dung dịch trước và sau phản ứng Sự thay đổi màu sắc của dung dịch phản ứng được thể hiện trên Hình 2. Trước phản ứng, dung dịch có màu xanh dương, là màu đặc trưng của ion Cu2+. Khi thêm NaBH4 vào hệ phản ứng và khuấy đều, dung dịch dần chuyển sang màu nâu đen, là màu đặc trưng của dung dịch đồng nano [3]. Phản ứng khử ion đồng Cu2+ bằng NaBH4 diễn ra như sau [5]: CuSO4 + 2 NaBH4 + 6 H2O → Cu + 2H3BO3 + 7H2 + Na2SO4 Usman và cộng sự đã chế tạo đồng nano sử dụng chitosan làm chất ổn định [6]. Kết quả dung dịch keo đồng nano thu được cũng cho màu nâu đen đặc trưng, tương tự như trong nghiên cứu của chúng tôi. Theo các nghiên cứu trước đây, đỉnh hấp thụ gây ra do hiện tượng plasmom của dung dịch keo đồng nano được ghi nhận trên phổ UV-vis trong khoảng bước sóng từ 500 – 600 nm [1], [7]. Hình 2 cho thấy trước phản ứng, khi vừa thêm NaBH4 vào dung dịch, chưa quan sát rõ đỉnh hấp thụ ở khoảng bước sóng trên. Sau phản ứng, xuất hiện hấp thụ cực đại tại 579 nm là bước sóng hấp thụ đặc trưng của dung dịch keo đồng nano [3]. SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No. 71 (05/2020) 38 Hình 3. Giản đồ XRD của chitosan và đồng nano ổn định bằng chitosan Giản đồ XRD của chitosan và vật liệu đồng nano ổn định bằng chitosan được thể hiện lần lượt ở Hình 3a và Hình 3b. Hình 3a cho thấy các đỉnh nhiễu xạ ở 2θ = 9,26° và 2θ = 19,82°, đây là hai đỉnh nhiễu xạ đặc trưng của chitosan [3], [8]. Đối với giản đồ nhiễu xạ của vật liệu đồng nano, ngoài 2 đỉnh nhiễu xạ của chitosan còn quan sát được 3 đỉnh có cường độ nhiễu xạ tương đối cao hoàn toàn trùng hợp với đỉnh nhiễu xạ chuẩn của kim loại đồng tại các góc 2θ = 43,35°; 2θ = 50,60° và 2θ = 74,17° tương ứng với các mặt (111), (200) và (220) thuộc ô mạng Bravais trong cấu trúc lập phương tâm diện của kim loại đồng [3], [7]. 3.2. Hình thái và kích thước hạt keo đồng nano Hình 4. Ảnh TEM và giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu đồng nano PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN 39 Hình 4 mô tả hình thái và kích thước của những hạt đồng nano. Hình ảnh cho thấy hạt có dạng hình cầu, phân bố khá đồng đều, kính thước hạt từ 2 đến 10 nm, đường kính trung bình vào khoảng 3,7 nm. Như vậy, sự có mặt của chitosan đóng vai trò là chất ổn định đã hạn chế được sự phát triển mầm, do đó kích thước hạt thu được tương đối nhỏ. Ngoài ra sự có mặt của chitosan còn được cho là tác nhân giảm thiểu sự oxy hoá bề mặt, ngăn cản sự keo tụ, làm bền cho hệ keo đồng nano [8]. Cơ chế ổn định keo đồng nano của chitosan đã được một số tác giả đề cập [1], [6], [8]. Theo đó, khi thêm Cu2+ vào dung dịch chitosan, ion Cu2+ được gắn vào đại phân tử chitosan bằng tương tác tĩnh điện. Nguyên tử oxy giàu electron của nhóm hydroxyl phân cực và của nhóm ether trong phân tử chitosan tương tác với điện tích dương của cation kim loại [9]. Nhờ đó, chitosan đóng vai trò vừa như một chất điều khiển sự tạo thành hạt nhân keo vừa như là một chất ổn định [10]. Ngoài ra, nhờ có nhóm amine và nhóm hydroxyl có ái lực mạnh với ion kim loại, chitosan được gắn với kim loại thông qua sự tạo phức bằng cách chuyển electron. Theo cách đó, chúng thúc đẩy sự tạo thành hạt nhân keo đồng. Sự hình thành phức giữa chitosan và Cu2+ làm cho khả năng khử ion đồng cũng diễn ra thuận lợi hơn [8]. 3.3. Khả năng kháng nấm của đồng nano ổn định bằng chitosan Hình 5. Sự phát triển của nấm mốc Aspergillus niger sau 5 ngày cấy trên đĩa petri Hình 5 là kết quả thử nghiệm hoạt tính diệt nấm mốc Aspergillus niger với các mẫu của đồng nano được ổn định bằng chitosan có nồng độ khác nhau. Sau 5 ngày nuôi cấy mẫu, kết quả cho thấy đối với mẫu đối chứng - không có đồng nano, nấm phát triển rất mạnh. Đối với các mẫu có chứa đồng nano khả năng phát triển của nấm mốc bị ức chế đáng kể sau 5 ngày nuôi cấy. Ở mẫu chứa đồng nano nồng độ 25 ppm nấm mốc phát triển tương đối yếu sau 5 ngày nuôi cấy so với mẫu đối chứng. Trong khi đó, các mẫu có đồng nano ở nồng độ 50 ppm và 100 ppm gần như không quan sát được sự phát triển của nấm mốc. Từ kết quả thí nghiệm có thể nhận thấy khả năng phát triển của nấm mốc Aspergillus niger đã bị ức chế gần như hoàn toàn ở nồng độ đồng nano là 50 ppm. Pariona và cộng sự (2019) đã tổng hợp đồng nano và khảo sát khả năng ức chế một số loại nấm như Fusarium solani, Neofusicoccum sp và Fusarium oxysporum [11]. Kết quả cho thấy nồng độ tối thiểu để cho hiệu quả ức chế hoàn toàn các loại nấm trên là 750 ppm lớn hơn nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi. Nguyên nhân có thể là do đồng nano thu được trong nghiên cứu của Parion là khoảng 8 nm, lớn SCIENTIFIC JOURNAL OF SAIGON UNIVERSITY No. 71 (05/2020) 40 hơn so với trong nghiên cứu của chúng tôi. Ngoài ra, sự khác biệt về các chủng nấm trong nghiên cứu của chúng tôi (Aspergillus niger) cũng có thể là nguyên nhân làm cho nồng độ ức chế nấm tối thiểu tương đối nhỏ. Nhìn chung khả năng kháng nấm và kháng khuẩn của đồng nano phụ thuộc vào nhiều yếu tố cho đến thời điểm này vẫn còn là một chủ đề mở cần tiếp tục bàn luận, đặc biệt khi chúng được ổn định bởi chitosan là một tác nhân cũng có hiệu ứng kháng khuẩn. Theo một số nghiên cứu gần đây, đối với vật liệu đồng được ổng định bằng chitosan, tốc độ khuếch tán của đồng nano được phóng thích (release) khỏi môi trường chitosan là yếu tố quyết định đến khả năng kháng khuẩn. Và vì vậy, cần chú ý là không phải kích thước hạt nhỏ của vật liệu sẽ cho hiệu quả kháng vi sinh vật tốt, vì trong trường hợp đó, khả năng hạt được bọc bởi một lớp polymer tương đối dày, dẫn đến tốc độ phóng thích chậm và hiệu quả kháng vi sinh vật trong trường hợp này thường không cao. Usman và cộng sự (2013) đã xem xét khả năng kháng khuẩn của đồng nano được ổn định bằng chitosan với các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy ở nồng độ chitosan 0,2% cho hiệu quả kháng vi sinh vật tốt nhất mặc dù kích thước hạt trung bình tương đối lớn hơn so với khi đồng nano được ổn định bởi dung dịch chitosan 0,5% [3]. Nhìn chung, hạt nano khi được ổn định bởi các loại polymer sinh học sẽ có thuận lợi trong việc kéo dài thời gian phóng thích, cải tiến được tính chất kháng vi sinh vật của chúng. Tuy vậy, nồng độ chất ổn định tối ưu cho hoạt động của các hạt nano vẫn là vấn đề cần được nghiên cứu. 4. Kết luận Đồng nano đã được chế tạo khá đơn giản bằng phương pháp khử hoá học sử dụng chitosan làm chất ổn định. Sự hình thành pha đồng nano đã được xác định dựa vào màu sắc đặc trưng và tín hiệu plasmom trên phổ UV-vis. Kết quả cho thấy các hạt đồng nano thu được có dạng hình cầu, kích thước hạt khoảng 3,7 nm. Dung dịch keo đồng nano thu được có khả năng ức chế tốt sự phát triển của nấm mốc. Ở nồng độ lớn hơn 50 ppm, đồng nano đã ức chế gần như hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc sau 5 ngày nuôi cấy. Với phương pháp chế tạo đơn giản, sản phẩm có hoạt tính kháng nấm cao, đồng nano rất có triển vọng để chế tạo với quy mô lớn làm các chế phẩm kháng nấm ứng dụng trong nông nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Tokarek. K, Hueso. J. L, Kuśtrowski. P, Stochel. G, Kyzioł. A, “Green Synthesis of Chitosan-Stabilized Copper Nanoparticles”, European Journal of Inorganic Chemistry, 2013 (28), 4940-4947, 2013. [2] Ponce. A. A, Klabunde. K. J, “Chemical and catalytic activity of copper nanoparticles prepared via metal vapor synthesis”, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 225(1), 1-6, 2005. [3] Usman. M. S, El Zowalaty. M. E, Shameli. K, Zainuddin. N, Salama. M, Ibrahim. N. A, “Synthesis, characterization, and antimicrobial properties of copper nanoparticles”, International journal of nanomedicine, 8, 4467, 2013. PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN 41 [4] Raffi. M, Mehrwan. S, Bhatti. T. M, Akhter. J. I, Hameed. A, Yawar. W, Ul Hasan, M. M, “Investigations into the antibacterial behavior of copper nanoparticles against Escherichia coli”, Annals of microbiology, 60(1), 75-80, 2010. [5] De. S, Mandal. S, “Surfactant-assisted shape control of copper nanostructures”. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 421, 72-83, 2013. [6] Usman. M. S, Ibrahim. N. A, Shameli. K, Zainuddin. N, Yunus. W. M. Z. W, “Copper nanoparticles mediated by chitosan: synthesis and characterization via chemical methods”, Molecules, 17(12), 14928-14936, 2012. [7] Dang. T. M. D, Le. T. T. T, Fribourg-Blanc. E, Dang. M. C, “The influence of solvents and surfactants on the preparation of copper nanoparticles by a chemical reduction method”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 2(2), 025004, 2011. [8] Manikandan. A, Sathiyabama. M, “Green synthesis of copper-chitosan nanoparticles and study of its antibacterial activity”, Journal of Nanomedicine & Nanotechnology, 6(1), 1, 2015. [9] Zain. N. M, Stapley. A. G. F, Shama. G, “Green synthesis of silver and copper nanoparticles using ascorbic acid and chitosan for antimicrobial applications”, Carbohydrate polymers, 112, 195-202, 2014. [10] Muzzarelli. R. A, “Potential of chitin/chitosan-bearing materials for uranium recovery: An interdisciplinary review”, Carbohydrate Polymers, 84(1), 54-63, 2011. [11] Pariona. N, Mtz-Enriquez. A. I, Sánchez-Rangel. D, Carrión. G, Paraguay-Delgado. F, Rosas-Saito. G, “Green-synthesized copper nanoparticles as a potential antifungal against plant pathogens”, RSC advances, 9(33), 18835-18843, 2019. Ngày nhận bài: 04/5/2020 Biên tập xong: 15/5/2020 Duyệt đăng: 20/5/2020