Chương I - Các kỹ thuật chính của công nghệ sinh học hiện đại

CHƯƠNG I - CÁC KỸ THUẬT CHÍNH CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI BÀI 1CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP Công nghệ DNA tái tổ hợp, còn được gọi là nhân dòng gen hay nhân dòng phân tử, là một khái niệm bao quát gồm một số quy trình thí nghiệm dẫn đến việc chuyển thông tin di truyền (DNA) từ sinh vật này sang sinh vật khác. THẾ NÀO LÀ DNA TÁI TỔ HỢP I. THU NHẬN GEN Vào năm 1969, Becwitt, Shapiro đã thông báo về công trình tách gen từ operon lactose của E. coli dựa trên cơ sở kết hợp các phương pháp di truyền vi sinh cổ điển với các phương pháp vật lý để tách và lai các phân tử DNA. Có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp DNA bằng ba phương pháp khác nhau. 1.Tách đọan ADN chứa gen từ bộ gen: Toàn bộ DNA được tách ra những đoạn nhỏ có chiều dài 15.000 – 20.000 cặp base bằng phương pháp lắc cơ học hay bằng enzyme cắt hạn chế. Sau đó gắn vào các vector mang gen tạo thành plasmid tái tổ hợp. Phương pháp này thường cho các đoạn DNA có kích thước khác nhau và không xác định chính xác đoạn DNA ta mong muốn. Tuy nhiên phương pháp này vẫn đựơc dùng trong việc tạo ra thư viện gen hay ngân hàng gen. 2.Tổng hợp bằng phương pháp hóa học Bằng hiểu biết về trình tự và sự sắp xếp các nucleotide trên gen, các acid amin trong chuỗi polypeptide mà người ta có thể tổng hợp đựơc các đoạn gen mong muốn bằng phương pháp hóa học. 3.Sinh tổng hợp gen từ mARN tương ứng Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào khả năng hoạt động của enzyme phiên mã ngược. Enzyme này có khả năng tổng hợp nên DNA một mạch (cDNA – complementary DNA) từ khuôn mARN hoặc cũng có thể từ một đoạn polyribonucleotide thu nhận đựơc từ quá trình tổng hợp hoá học. II. VECTOR TÁCH DÒNG Vector tách dòng (cloning vector) gồm nhiều loại như plasmid, phage, cosmid, virus, ….Mỗi loại vector tách dòng có những ưu, nhược điểm nhất định. Tùy thuộc kích thước của gen tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ để chọn loại vector tách dòng thích hợp. 1. Các vector đối với E.coli Các vector tách dòng đơn giản nhất, được sử dụng rộng rãi nhất là dựa trên các plasmid vi khuẩn. Một lượng lớn các vector plasmid khác nhau có thể sử dụng cho E.coli. Ưu điểm của các vector này là: dễ làm sạch, hiệu quả biến nạp cao, các marker chọn lọc thuận tiện cho biến nạp và tái tổ hợp, có khả năng tách dòng các mẫu DNA lớn tới 5kb. PLASMID 2. Vector đối với nấm men và các nấm khác: Nấm men S.cerevisiae là một trong những cơ thể quan trọng nhất trong công nghệ sinh học. 3.Vector đối với thực vật bậc cao: * Vector tách dòng là vi khuẩn A. tumefaciens: A. tumefaciens là VK Gram (-), tạo nên các nốt sần trên cây trồng khi bị nhiễm. Việc tạo nên các nốt sần chính là kết quả của việc chuyển đoạn T-DNA của plasmid Ti vào bộ gen tế bào thực vật. * Vector tách dòng là virus Cauliflower mosaic: Hầu hết virus thực vật là virus RNA nên rất khó biến nạp, chỉ có Geminvirus và Caulimovirus (CaMV) là virus DNA. 4. Vector đối với tế bào động vật có vú: * Vector dựa trên SV40: - SV40 (Simian virus) có khả năng gây nhiễm một số loài động vật có vú. - Bộ gen của SV40 nhỏ (khoảng 5,2kb) và chỉ dung hợp được vài trăm nucleotide. * Vector virus khác của động vật có vú: Bovine papilloma virus (BPV) chủ yếu gây ra mụn cóc trên bò nhưng cũng gây nhiễm trên các loài khác. Trong các tế bào chuột, BPV có nhiều bản sao 100 phân tử/tế bào. III. ENZYME GIỚI HẠN VÀ MỘT SỐ ENZYME THƯỜNG DÙNG 1. Enzyme giới hạn Enzyme giới hạn (Restriction enzyme – RE) có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài. Số lượng và kích thước đọan cắt dài hay ngắn tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Mỗi dòng tế bào và vi khuẩn đều có hệ thống enzyme cắt hạn chế chuyên biệt, các enzyme này có khả năng phân biệt DNA của mình và đoạn DNA lạ, do đó nó không cắt DNA của chính mình hay DNA đã thích nghi với tế bào. a.Tên gọi các enzyme: b. Các loại enzyme giới hạn: Hiện nay có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 6 cặp nucleotide người ta chia enzyme giới hạn làm 3 loại: Loại thứ nhất: Loại thứ hai: Loại thứ ba: c.Các kiểu cắt của enzyme giới hạn: Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định. Có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le. Cắt tạo đầu bằng (Blunt ends): một số RE cắt 2 mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp trở lại. Để nối chúng lại phải dùng enzyme T4 ligase. Cắt tạo đầu dính (cohesive ends): ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Đoạn ADN lạ và vector khi được cắt bởi cùng một lọai enzyme cắt hạn chế sẽ có thể nối lại với nhau nhờ enzyme nối Ligase Người ta sử dụng tính chất này để cắt và ghép gen. 2. Một số enzyme thường sử dụng trong kỹ thuật gen a. Enzyme polymerase: Là các enzyme xúc tác quá trình tái bản DNA, phiên mã tổng hợp RNA. - Enzyme DNA polymerase I (pol I) - Enzyme T4 DNA polymerase - Enzyme Taq polymerase - Enzyme RNA polymerase b. Enzyme DNA ligase: Enzyme ligase là các enzyme xúc tác hình thành các liên kết, nối 2 đoạn acid nucleic với nhau. - Enzyme T4 DNA ligase: - Enzyme T4 RNA ligase: c. Các enzyme nuclease: - Enzyme DNase I - Nuclease S1 - RNase A - RNase H IV. DNA TÁI TỔ HỢP Công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp các kỹ thuật gắn xen hoặc nối các gen lạ (các đoạn DNA ngoại lai) cần thiết vào vector tách dòng, tạo vector tái tổ hợp, chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ để vector tái tổ hợp được nhân lên với một lượng lớn bản sao trong tế bào chủ. Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp Nối các đoạn DNA nhờ enzyme nối Cải tiến đầu dây nhờ các đoạn linker Phương pháp tạo đuôi homopolymer 1. Tạo DNA tái tổ hợp bằng enzyme nối 2. Cải tiến đầu dây nhờ các đoạn linker 3. Phương pháp tạo đuôi homopolymer