Chương II Công nghệ gene (genetics engeneering)

CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING) Nguyễn Vũ Phong Chương II QUY TRÌNH TIẾN HÀNH Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho Bước 2: Tách DNA plasmind và DNA tế bào cho Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu Bước 4: Nối 2 loại DNA bằng enyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là vi khuẩn E.coli) Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom) Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) . 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau. Quy tắc đặt tên: EcoRI Eco: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự RE được tìm ra (I: đầu tiên) 1. Enzyme 1.2. Enzyme nối (Ligase) - Nối : hình thành cầu phosphodiester Ligation. (ligere = latin ‘to join’) 1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in an ATP (or NAD+ dependent manner depending on the source of ligase)  activated enzyme. 2. Activated enzyme donates AMP to free 5’-PO4= at the nick in the lower strand of the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick. 3. Cleavage of the di-phosphate bond liberates energy to create a new phosphodiester bond. Seals the nick in the DNA. N.B. Reaction can occur on Both Strands, allowing joining of two independent DNA molecules. 1. Enzyme 1.3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Tổng hợp DNA một mạch c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp c-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA 1.4. Các enzyme khác 1. Enzyme 2. Các vector chuyển gene Plasmid: DNA vòng tròn Sao chép độc lập trong tế bào Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein Vector: Có khả năng tự tái bản Tồn tại độc lập trong tế bào Mang được gene mong muốn Yêu cầu đối với vector chuyển gene. Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) Trình tự nhận biết cho RE Trình tự điều hòa (promoter) Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết. 2. Các vector chuyển gene Ứng dụng của vector chuyển gene Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình tự DNA Chuyển gene Sản xuất RNA Sản xuất protein từ gene được tạo dòng. 2.1. Vector chuyển gene plasmid Plasmid của vi khuẩn và bacteriophage. pBR322 2. Các vector chuyển gene 2.2. Phage λ Có hệ thống xâm nhập tự động và sinh sản Có dạng tròn hoặc dạng thẳng, 2 đoạn cos (12 nu) ở 2 đầu mút, dùng tạo cosmid và phagemid Mang được đoạn DNA (15-23Kb) Dùng trong thành lập ngân hàng gene 2. Các vector chuyển gene 2.3. Cosmid : Plasmid gắn thêm đoạn cos của phage, Có thể chứa đoạn gene dài đến 45kb Dùng lập thư viện gen 2. Các vector chuyển gene 2.4. Phagemid 2.5. Phage M13: DNA mạch đơn Dùng xác định trình tự nucleotide của gene Sản xuất mẫu dò (probe) Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) 2. Các vector chuyển gene 2.5. Plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen ở thực vật 200Kb Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào 2. Các vector chuyển gene 2.6. Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC-yeast artificial chromosome) - Plasmid vòng tròn 2m Chứa đoạn DNA lạ dài đến 2000Kb 2. Các vector chuyển gene 2.7. Các nhiễm sắc thể nhân tạo khác BAC (Bacterial artificial chromosome) MAC (Mammalian artificial chromosome) P1AC (P1 bacteriophage derived artificial chromosome) 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) Mục đích: Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng. Biểu hiện gene Sản xuất protein tái tổ hợp. 3.1. Escherichia coli (E.coli) Dễ nuôi cấy và nhân dòng Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau. Vi khuẩn Gram-, hình que, Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.2. Saccharomyces cerevisiae Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học. Sản xuất protein tái tổ hợp Sinh vật an toàn 3.3. Hệ thống tế bào thực vật 3.4. Hệ thống tế bào động vật Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) Lai nucleic acid Tách chiết và tinh sạch DNA và RNA Điện di trên gel Small Large Kỹ thuật và phương pháp căn bản Lai nucleic acid Lai trên pha rắn Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot Kỹ thuật và phương pháp căn bản Lai nucleic acid Lai trên pha rắn Kỹ thuật và phương pháp căn bản Dot và slot blot dùng cho RNA và DNA Lai nucleic acid Lai trên pha rắn Lai tại chổ (in situ hybridisation): nghiên cứu nucleic acid tại chổ không cần phải tách chiết ra ngoài Kỹ thuật và phương pháp căn bản 2. Thu nhận gene Thu nhận DNA từ bộ gene * Shotgun * Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA) Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron) * Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật và phương pháp căn bản 2. Thu nhận gene Thu nhận DNA từ bộ gene Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học Lập ngân hàng c-DNA * Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron) * Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3. Tạo plasmid tái tổ hợp Dùng đầu so le Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3. Tạo plasmid tái tổ hợp Dùng đầu so le Dùng các đoạn nối (linkers) Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3. Tạo plasmid tái tổ hợp Dùng đầu so le Dùng các đoạn nối (linkers) Dùng enzyme terminal transferase Kỹ thuật và phương pháp căn bản 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào Hóa biến nạp Tế bào vi khuẩn không có plasmid có khả năng dung nạp (competent cell) Ủ hỗn hợp, xử lý CaCl2 lạnh + sốc nhiệt (42oC, 2 phút) Kỹ thuật và phương pháp căn bản 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp b) Điện biến nạp (electroporation) Kỹ thuật và phương pháp căn bản 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp b) Điện biến nạp (electroporation) c) Vi tiêm (micro-injection) d) Bắn gene .... Kỹ thuật và phương pháp căn bản 5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp Kỹ thuật và phương pháp căn bản 5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp Kỹ thuật và phương pháp căn bản b) Tạo dòng c) Sự biểu hiện của gene được tạo dòng Vector biểu hiện Yêu cầu: Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào Promotor biểu hiện Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt Sự ổn định lâu dài Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào PCR (Polymerase Chain Reaction) 1985, Kary Mullis 1. Nguyên tắc 2. Các thành phần của phản ứng Primer Polymerase chịu nhiệt dNTP Dung dịch đệm PCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau. 1. 1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94oC 2. Bắt cặp: lai giữa primers và dây đơn DNA. Nhiệt độ thay đổi tùy theo, khoảng 50oC 3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và dNTPs: 72oC. Lập lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di PCR (Polymerase Chain Reaction) 3. Ý nghĩa Thời gian Hiệu quả kinh tế Thực hiện 4. Cách dạng PCR khác RT-PCR Competitive RP-PCR Real Time PCR PCR- ELISA Sequencing Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert Sequencing Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert Phương pháp didesoxy của F. Sanger Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA các bộ gene 1.1. Genomics: Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng. 1.2. Proteomics Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function) Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh. 1.3. Human Genome Projet 1.4. Các ngành học khác Cellomics Metabolomics Ionomics Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA rRNA, mRNA, tRNA ribozyme RNAi, microRNA Mạng lưới RNA Thụ động Slipcing Postranscriptional regulation Công nghệ RNA Antisense RNA Interfering RNA và microRNA Các ribozyme Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp - Sản xuất r-protein Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Sản xuất r-protein Chế tạo protein * Nối các đoạn gene tạo protein dung hợp (fusion protein) * Làm mất đoạn hoặc tăng đoạn gene * Thay thế nucleotide Ứng dụng công nghệ gene Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Chẩn đoán phân tử Dựa trên phương pháp lai DNA DNA marker Biomarker DNA fingerprinting Micro array và Biochips 5. Vi sinh vật chuyển gene 6. Thực vật chuyển gene 7. Động vật chuyển gene Khai thác DNA các bộ gene Công nghệ RNA Công nghệ protein tái tổ hợp Chẩn đoán phân tử 5. Vi sinh vật chuyển gene 6. Thực vật chuyển gen 7. Động vật chuyển gene 8. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân * Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị Pharmacogenomics: Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân Gene therapy: * Dùng rprotein hoặc bổ sung enzyme * Thay thế gene Ứng dụng công nghệ gene Hết chương II Còn 4 chương lý thuyết và 8 seminars Hẹn tuần sau !