Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum

Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum :Từ ba tiền chất ban đầu là a-aminoadipic, cystein và valin sẽ tổng hợp lại thành tripeptit d -(a- aminoadipyl) - cysteinyl - valin .Tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng b-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N.Rồi trao đổi nhóm a-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V., Có 2 phương pháp chủ yếu: 1.Phương pháp lên men bề mặt:Áp dụng từ lâu, hiện nay hầu như không còn được triển khai trong sản xuất lớn nữa. Gồm 2 phương pháp:Lên men trên nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose)Lên men trên bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường cơ bản lactose - nước chiết ngô).. Quá trình sản xuất chungNguyên liệu:Cám và hạt ngũ cốc các loại thường được sử dụng như nguyên liệu chính trong sản xuất Penicilin bằng phương pháp bề mặt. Nguyên liệu được bổ sung nước sao cho độ ẩm khối nguyên liệu đạt 50% đến 60%. Sau đó được thanh trùng ở 121oC, 0,5at . trong 30 đến 45 phút. Ngay sau khi kết thúc thanh trùng, người ta rải chúng ra các khay hình chữ nhật có kích thước dài 1-1,2m, rộng 0,6-0,8m, cao 5-6cm. lớp môi trường cho vào đó dày 2-3 cm để đảm bảo thoáng khí mặt trên và dưới của môi trường. Trường hợp sử dụng cám quá mịn, người ta phải độn thêm trấu xay nhỏ hoặc cùi bắp đã xay nhỏ trước khi thanh trùng Nguồn thức ăn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường ( glucoza, fructoza, maltoza, lactoza …) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, các loại rượu, dịch thủy phân gỗ, nước thải hồ sunfit…Nguồn thức ăn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm nem, pepton, các muối NO3-, NH4+…Các nguyên tố khoáng đa lượng thường gặp như: photpho, lưu huỳnh, ma nhê, sắt, canxi, kali, natri; các nguyên tố vi lượng như: đồng, kẽm, coban, molipden… và các chất sinh trưởng..Môi trường lên men :Cao ngô (loại đậm đặc) : 3.5% Lactose : 3.5% Glucose : 1.0% Canxicabonat :1.0% KH2PO4 : 0.4% pH sau thanh trùng : 6Quá trình nhân giống:Quá trình nhân giống bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm. Trong các nhà máy, mỗi lần cấy chuyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống:- một ống dùng kiểm tra trước khi sản xuất, - một ống dùng để sản xuất.- Một ống dùng để bảo quản.Để làm môi trường nhân giống người ta cũng làm giống như trên. Chỉ có một điều khác là sau khi làm ấm môi trường đến độ ấn nhất định, người ta phân phối chúng vào các dụng cụ thủy tinh với khối luợng bằng 1/5 hay 1/6 với dung tích của dụng cụ, đậy nút bông và đem thanh trùng ở 121oC 0,5at trong 30 phút, sau khi để nguội mới cấy giống vào.Đổ 10ml nước đã thanh trùng và làm nguội vào ống giống, lắc cho thật đều và chuyển chúng sang tủ ấm 30-37oC nuôi đến khi bào tử xuất hiện vá phát triển khắp môi trường, gọi là quá trình nhân giống cấp 1. Cứ lần lượt thực hiện tiếp ta có giống cầp 2, cấp 3…… cho đến khi có đủ 5-10% giống cho sản xuất. Quá trình lên men.Nấm Penicilin trong quá trình phát triển thường tạo ra ít nhiệt hơn nấm Aspergillus. Tuy nhiên người ta thường thổi khí bằng quạt gió có lấp hệ thống làm sạch để tăng cường khả năng phát triển và sinh tổng hợp.Quá trình lên men kéo dài 6-7 ngày ở nhiệt độ 24-28oC. Váng nấm sợi được giữ lại sau khi rút hết dịch lên men, được tiếp tục sử dụng cho những lần lên men kế tiếp. ở những lần lên men tiếp theo ta chỉ việc đổ thêm dịch lên men vào. Các thí nghiêm cho thấy chỉ nên tái xử dụng váng nấm sợi này 3-4 lần, vì những lần sau hiệu suất thu nhận kháng sinh sẽ giảm dần. 2.Phương pháp lên men chìm.Sơ đồ công nghệ lên men sản xuất kháng sinh Kỹ thuật lên men chìm Kỹ thuật len men chìm là kỹ thuật được áp dụng trong hầu hết các cơ cở sản xuất penicillin công nghiệp hiện nay .Được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) một hay một vài cấu tử .kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên men trước (hoặc không)Quá trình nhân giống:Trong phương pháp lên men chìm, ngừơi ta thường sử dụng môi trường lỏng. Để làm môi trường lỏng người ta sử dụng cao ngô, glucose, hydro, lactose, các muối amon, thiosunfat, photphat kali hoặc natri, Quá trình lên men chìm người ta nhân giống trong môi trường lỏng, mục tiêu là thu được số lượng tế bào cao. Môi trường nhân giống trong lên men penicillin khác với môi trường sản xuất là chúng không chứa lactose, một số kháng chất và tiền chất.Môi trường:Môi trường được thanh trùng ở 121 trong thời gian 30 phút, để nguội và nhân giống.Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì ở nhiệt độ 26_+1 .và thời gian ở mỗi cấp độ khoảng 72 giờ. Trong hầu hết các trường hợp, khi lên men, người ta thay thế phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose bằng đường glucose. Lượng glucose này có thể được bổ sung liên tục hay bán liên tục nhưng phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose trong suốt quá trình vận hành pha để duy trì nồng độ glucose luôn ở mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin.Trong thực tiễn, để tránh xảy ra thiếu hụt nhất thời glucose , người ta có thể kết hợp bổ sung một lượng nhỏ đường lactose (khi đó, nếu chưa bổ sung kịp glucose thì nấm mốc sẽ tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy ra hiện tượng tự phân hệ sợi). Ngoài nguồn nitơ trong nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N và S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trong quá trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường được điều chỉnh về khoảng pH = 6,5 – 6,8 bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế trong khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men. Chất phá bọt thường sử dụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic trong lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic trong lên men sản xuất penicillin V) được bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) trong suốt thời gian pha lên men penicillin, để duy trì nồng độ trong khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu ít quá nấm mốc sẽ tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nếu nhiều quá sẽ gây độc cho nấm và tăng cường thúc đẩy quá trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin). Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin Seed tankFermentorSơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiênQuá trình lên menGồm hai pha:Pha thứ nhất: pha sinh khối. Tốc độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh. Sự tạo thành penicillin mới bắt đầu.Pha thứ 2: hệ sợi phát triển chậm lại, trong pha này penicillin được tạo ra với mức độ cực đại .Càng nhiều sinh khối thì hàm lượng penicillin sẽ càng nhiều. Do đó cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và oxi. Song sinh khối cao không bao giờ cũng cho nhiều penicillin.Nhiệt độ: 26oC, pH: 7-7.5, thổi khí 1.2-1.5 thể tích/lít/phút.Sự tích tụ penicillin thường xảy ra mạnh mẽ khi hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân bằng. Trạng thái này có thể xác lập được khi chỉ cung cấp vừa đủ và liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc. Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm sẽ tự phân, còn nếu cung cấp quá nhu cầu trên, hệ sợi sẽ phát triển, nhưng không tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic và axit malic.Trong sản xuất penicillin, cần xem xét các thông số sau đây : tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, nhu cầu duy trì cơ thể (g glucose/ g tế bào/ h), tốc độ sản sinh penicillin riêng phần (q pen) đối với một cơ thể (mg penicillin /g tế bào/ h) và năng suất penicillin trên g glucose. Ngoài ra, thời gian lưu trong nồi lên men, dung tích bể, thời gian chế biến, môi trường và chi phí nhân công là những nhân tố bổ sung có tấm quan trọng công nghiệp. .Khi lên men kết thúc, toàn bộ môi trường lên men được lọc và sợi nấm cũng như mọi chất rắn khác đều được loại bỏ. Dịch lọc được acid hóa đến khoảng pH 4 rồi penicillin được chiết trong một loại dung môi như butyl acetate.Sau đó penicillin được kết tủa khỏi dung môi nhờ bổ sung acetate kali và được thú hồi nhờ biện pháp lọc.Ở bước tiếp theo, nó có thể được kết tinh lại từ isopropanolNhân giống và lên men4 ngày pH6.8-7.4 25oC 8-10 ngày pH 4 butyl axetat axetat kali isopropanol Lọc dịch lên men : Mục đích: Penicillin là sản phẩm lên men ngoại bào. Vì vậy, ngay sau khi kết thúc quá trình lên men người ta thường tiến hành lọc ngay để giảm tổn hao do phân huỷ penicillin và giảm bớt khó khăn khi tinh chế, do các tạp chất tạo ra khi hệ sợi nấm tự phân. Thiết bị lọc: phổ biến là thiết bị lọc hút kiểu băng tải hoặc kiểu thùng dịch ngay để chuyển sang công đoạn tiếp theo. Chỉ trong những trường hợp rất đặc biệt mới cần phải xử lý kết tủa một phần protein và lọc lại dịch lần quay. Thông thường, người ta chỉ cần lọc một lần rồi làm lạnh thứ hai. Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu quả làm cho dịch khó lọc hơn.Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm được rửa sạch, sấy khô và sử dụng để chế biến thức ăn gia súc. Thu nhận và tinh chế kháng sinhXử lý dịch lên men và tinh chế thu penicillin tự nhiên Có ba phương pháp thu nhận và tinh chế penicillin từ môi trường nuôi cấy, đó là:·         Trích ly bằng dung môi hữu cơ·         Hấp phụ·         Trao đổi ionTrong ba phương pháp trên thì phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ được sử dụng nhiều hơn cả Thu nhận và tinh chế penicillin bằng dung môi Quá trình chiết bằng dung môi hữu cơ được thực hiệ qua hai giai đoạn :Giai đoạn 1 :Trộn nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc.làm như vậy để các phần tử kháng sinh tiếp xúc chặt chẽ với dung môi.Tiến hành khấy lien tục để đảm bảo quá trình tiếp xúc này đạt được mức độ cao nhất.Giai đoạn 2:Sau khi tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi sẽ tạo kết tủa.Những dung môi sau đây được dùng để kết tủa kháng sinh:-các ancol:butanol,isopropanol,propanol-Các ester :actete etyl,butyl,amyl.-Các ceton:metyl etyl acetone,metyl butyl ceton-Các ete: ete isopropylic,dioxin-benzen,phenol,pyridine,dicloetan,clorofoc.Để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.Phương pháp ly tâm vừa nhanh vừa có hiệu quả nhấtQuá trình chiết bằng dung môi hữu cơ được thực hiện qua 2 giai đoạn:Giai đoạn thứ nhất: trộn nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc. Giai đoạn thứ hai: sau khi trộn giữa dung môi và kháng sinh sẽ taọ ra kết tủa. để tách kết tủa ra khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.Trong các phòng thí nghiệm và cả trong sản xuất công nghiệp, người ta thường dùng những dung môi sau để tiến hành thu nhận kháng sinh:Các ancol: butanol, isopropanol, propanol.Các ester: acetate etyl, butyl, amyl.Các ceton: metyl etyl aceton, metyl butyl ceton.Các ete:ete isopropylic,dioxan.Benzen, phenol, pyridin, dicloetan, lorofoc.Một trong những phương pháp được sử dụng rất co hiệu quả để thu nhận kháng sinh là phương pháp phân tán tĩnh điện. phương pháp này thay thế cho phương pháp trích ly bằng dung môi.Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng một hiệu điện thế cao để tạo những vi giọt của dung dịch chứa penicillin.Một số lượng rất lớn các vi giọt sẽ chuyển động rất nhanh. Kết quả là tạo ra được vận tốc chuyển động vật chất và tốc độ trích ly sẽ tăng nhanh.Phương pháp này có những ưu điểm sau:Do thời gian thực hiện ngắn nên không làm thay đổi hoạt chất sinh học của vật chất cấn thu nhận.