Công nghệ Enzym -Protein

Công nghệ Enzym - Protein Đại cương  Công nghệ enzym: ứng dụng enzym hoặc xúc tác sinh học để tạo ra sản phẩm hay dịch vụ  Ứng dụng của enzym  Công nghiệp:  Thực phẩm: Làm bánh mì, rượu bia, các sản phẩm sữa  Tẩy rửa: protease, lipase  Xử lý tinh bột: các amylase, isomerase  Dệt-da: amylase, lipase, cellulase  Y Dược  Trợ tiêu hóa: amylase, protease  Chẩn đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase, Creatinase, Glucose oxidase, Uricase  Điều trị: Asparaginase, Lactamase, Urease, Uricase, Streptokinase  Hóa dược: Steroid, Ibuprofen, Salbutamol, Propanolol  Nghiên cứu: Endonuclease, RNase, DNase, Polymerase, Ligase Khái niệm xúc tác sinh học  Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học,  Bản chất là protein  Giúp phản ứng đạt được điểm cân bằng nhanh hơn  Enzym không thể xúc tác phản ứng với sự thay đổi năng lượng tự do không thuận lợi trừ khi phản ứng đó có thể song hành với một phản ứng khác có sự thay đổi năng lượng tự do thuận lợi hơn  Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều kiện bình thường về áp suất, nhiệt độ, pH Công nghệ enzym hiện đại  Hóa học protein  Lý sinh phân tử  Sinh học phân tử  Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym  Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym Nhu cầu sử dụng enzym Chỉ tiêu Công nghiệp Phân tích Dược phẩm Lượng sử dụng Tấn Milligam  gam Milligam  gam Độ tinh khiết Không tinh khiết Tinh thể tinh khiết Tinh thể tinh khiết Nguồn gốc Vi sinh vật, thường ngoại bào Vi sinh vật, động vật, thực vật, thường nội bào Vi sinh vật, động vật, thực vật, thường nội bào Giá sản xuất Thấp Trung bình Cao Xúc tác sinh học  Tính chọn lọc cao  Chọn lọc theo vị trí nhóm hóa học  Chọn lọc không gian  Hoạt động trên cơ chất đa dạng  Hoạt động được trong môi trường không phải là nước  Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao  Có độ bền đủ cao  Tính kinh tế Tính chọn lọc theo vị trí N N N N O CH3 NH2O OHHO HO N N N N O CH3 NH2O OHHO O CH3 O 5'vinyl acetat C. antarctica lipase Dẫn xuất Purine (Nelarabine) Sản phẩm acyl hóa Tính chọn lọc không gian COOCH3 H3CO COOH H3CO COOCH3 H3CO lipase H2O + (R,S)-naproxen methyl ester (S)-naproxen (R)-naproxen methyl ester Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu  Chiết tách  Động vật  Thực vật  Lên men  Vi sinh vật  Nuôi cấy tế bào  Công nghệ gen Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu  Chiết tách từ mô: lysozym, papain, bromelin, …  Lên men bề mặt: amylase, protease nấm mốc  Lên men chìm: các enzym dùng trong phân tích và y học  Qui mô lớn: enzym thô dùng trong công nghiệp  Qui mô nhỏ: enzym dùng trong y học  Chủng được chọn lọc thông qua biến đổi di truyền  Tăng hoạt tính  Tính ổn định  Nhiệt độ, pH tối ưu  Chuyển gen sản xuất enzym vào các ký chủ dễ nuôi cấy Phương pháp sản xuất - Tổng quát Chuẩn bị nguyên liệu Chiết tách Cô đặc Tinh chế Hoàn chỉnh sản phẩm • Loại bỏ mô tạp • Phá vỡ tế bào • Ly tâm, lắng • Tủa bông • Lọc • Bay hơi • Tủa • Siêu lọc • Kết tinh trực tiếp • Sắc ký • Hấp phụ • Cô đặc • Kết tinh • Đông khô • Ổn định Chuẩn bị nguyên liệu sinh học  Cơ quan động vật  Loại chất béo và mô liên kết trước khi đông lạnh  Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý  Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với dung dịch đệm.  Enzym để phá vỡ tế bào  Nguyên liệu thực vật  Thực vật có thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm.  Tế bào cũng có thể được phá vỡ bằng cách xử lý với enzym.  Vi sinh vật  Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men.  Nội bào: phá vỡ tế bào Các phương pháp phá vỡ tế bào  Áp suất cao (Manton - Gaulin, French- press)  Nghiền (máy nghiền bi)  Siêu âm  Làm khô (đông khô, dung môi hữu cơ)  Ly giải:  Vật lý: đông lạnh, sốc thẩm thấu  Hóa học: chất tẩy, kháng sinh  Enzym: lysozyme, kháng sinh French-press Sản xuất enzym - Chiết tách  Tách dịch enzym ra khỏi các phần khác.  Lắng  Ly tâm liên tục  Lọc  truyền thống  lọc áp suất, lọc chân không  lọc chảy qua (cross-flow filtration).  Phương pháp kết bông Cô đặc  Bay hơi  Kết tủa  Muối  Dung môi hữu cơ  Polymer  Siêu lọc Tinh chế  Kết tinh  Điện di  Sắc ký Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực Đánh bắt ion kim loại Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử Nguyên lý Sắc ký Nguyên lý Sắc ký Chọn Phương pháp sắc ký GF = Lọc gel AC = Sắc ký Ái lực IEX = Sắc ký Trao đổi Ion HIC = Sắc ký Tương tác kỵ nước RPC = Sắc ký Pha đảo Ví dụ tinh chế amylase bằng hấp phụ Dịch Enzym thô Phức Enzym Alginat natri Tủa Enzym Alginat Calci Dịch Enzym tinh • Natri alginat • Calcium chlorid • Lọc lấy tủa • Phản hấp phụ • Lọc lấy dịch Dịch tạp chất Alginat Calci Sản phẩm amylase • Cô đặc • Thẩm tích Ví dụ sản xuất Taq polymerase Thermus aquaticus hay E.coli tái tổ hợp Môi trường Lên men Thu tế bào Phá tế bào Tủa (NH4)2SO4 Thẩm phân Cột DEAE Cột Hydroxyapatide Cột DEAE Cột phosphocellulose Taq polymerase tinh khiết Môi trường thừa Xác tế bào Dịch nổi Enzym cố định  Ưu điểm  Enzym có thể được sử dụng lặp lại nhiều lần  Chế phẩm bền hơn enzym tự do  Enzym cố định có tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động hóa cao.  Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm cuối  Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại  Nhược điểm  Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.  Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất. Vật liệu cố định  Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp  Chất mang phải có tính cơ lý ổn định  Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không hòa tan trong môi trường phản ứng.  Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn  Có khả năng trương nở trong môi trường Các phương pháp cố định enzym Đặc tính Phương pháp liên kết với chất mang Phương pháp khác Hấp phụ vật lý Liên kết ion Liên kết đồng hóa trị Liên kết chéo Bắt giữ Kỹ thuật Dễ Dễ Khó Khó Khó Hoạt tính enzym Thấp Cao Cao Trung bình Cao Tính đặc hiệu cơ chất Không đổi Không đổi Thay đổi Thay đổi Không đổi Lực liên kết Yếu Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh Khả năng tái cố định Có thể Có thể Không Không Không Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Trung bình Thấp Cao Chi phí cố định Thấp Thấp Cao Trung bình Thấp Cố định thuận nghịch E E Hấp phụ E + - E + - E + - Liên kết ion E E E Liên kết ái lực Liên kết ion kim loại hoặc chelate E Me- E Me- E E S S E S S E S E Liên kết disulfit Me- S Cố định không thuận nghịch E E E Liên kết đồng hóa trị E E E E Bắt giữ E E E E E E E Tạo vi hạt bao E E E E E E E Liên kết chéo Ứng dụng enzym trong ngành dược  Liệu pháp enzym  Enzym trong sản xuất thuốc Trị liệu bằng enzym  Thay thế enzym do bệnh di truyền  Thay thế enzym do một bệnh mắc phải  Cung cấp tác dụng sinh học đặc hiệu  Dùng trong điều trị hỗ trợ khi phối hợp với các liệu pháp khác, hay để giải độc máu hay mô. Liệu pháp enzym - Yêu cầu của enzym  Phải đến được vị trí tác động của chúng trong cơ thể hay mô.  Phải có hoạt tính trong các điều kiện môi trường tại nơi tác động.  Chúng phải đủ bền để có được các thông số dược động học cần thiết,  Độ tan thỏa mãn yêu cầu nếu được dùng theo đường tiêm bắp hay dưới da.  Độ tinh khiết đủ cao  Có hiệu quả điều trị dựa trên hoạt tính đặc hiệu của enzym được dùng. Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh  An toàn đối với bệnh và chỉ định điều trị  Dạng sử dụng thuận tiện Các vấn đề của thuốc protein  Không ổn định  Sinh khả dụng  Tính thấm tế bào  Tính chất gây miễn dịch  Phản ứng dị ứng  Sản xuất và kiểm định  Lợi thế  Ít tác dụng phụ hơn  Thời gian phát triển ngắn  Tỷ lệ thành công khi xin cấp phép cao Thách thức  Cải thiện tính ổn định  PEG, liên kết chéo  Phóng thích có kiểm soát  Bao bảo vệ  Cải tiến phân tử  Giảm tính miễn dịch  Định hướng đặc hiệu  Khả năng xuyên màng tế bào Nguồn enzym  Chiết xuất - Tinh chế:  Không phải người: nấm, vi khuẩn, động vật, thực vật  Gây miễn dịch  Dùng ngoài  Yêu cầu thấp  Người  Giới hạn công suất, nguyên liệu hạn chế  Nhiễm virus và các yếu tố gây bệnh khác  Tái tổ hợp  Sử dụng gen người tái tổ hợp trong tế bào khác  Cải thiện hoạt tính, đặc điểm thông qua cải tiến trình tự Hệ thống sản xuất  Nuôi cấy tế bào người – động vật  Chất lượng tốt  Năng suất giới hạn  Nhiễm virus  Nấm men  Thực hiện được một số biến đổi hậu dịch mã  Vi khuẩn  Năng suất cao  Không thực hiện được biến đổi hậu dịch mã  Sinh vật chuyển gen  Liệu pháp gen Sản xuất thuốc bằng công nghệ enzym cnshduoc@gmail.com` Thuốc đối quang  Cấu trúc không gian của phân tử sinh học và thụ thể  Chỉ một trong hai đồng phân có hoạt tính,  Các đồng phân có hoạt tính khác nhau  Dược động học và chuyển hóa khác nhau  Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure  Bản quyền đồng phân Thuốc đối quang Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân Thuốc chẹn β: propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol, betaxolol, carvedilol, meto-prolol, labetalol, pindolol, sotalol, … l > d (d = không có hoạt tính) Ví dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol Thuốc chẹn kênh calci: verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine, felodipine, mandipine … l > d Ví dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil Thuốc giãn phế quản: albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline l > d (d = không có hoạt tính) Ví dụ: R(-)-albuterol > S(+)- albuterol An thần: hexobarbital, secobarbital, mephobarbital, pentobarbital, thiopental, thiohexital l > d Ví dụ: S(-)-secobarbital > R-(+)secobarbital Thuốc gây mê: ketamine, isoflurane d > l (l = không có hoạt tính) Ví dụ: S(+)-ketamine > R(-)-ketamine S(+)-isoflurane > R(-)-isoflurane Giảm đau tác động trung ương: Methadone Ví dụ: R(-)-methadone > S(+)-methadone Kháng viêm không steroid: ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen d > l Ví dụ: S(+)-ibuprofen > R(-)-ibuprofen An thần: nhóm 3-hydroxy-benzodiazepines: oxazepam, lorazepam, temazepam d > l (l = không có hoạt tính) Ví dụ: S(+)-oxazepam > R(-)- oxazepam Thuốc đối quang - racemic Thuốc: 668 Không bất đối: 2 Bất đối: 145 Chế phẩm một đồng phân: 119 Tự nhiên/ bán tổng hợp: 147 Chế phẩm dạng racemic: 8 Bất đối: 252 Không bất đối: 269 Chế phẩm dạng racemic: 140 Tổng hợp: 521 Chế phẩm một đồng phân: 110 Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym Lớp enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác EC 1 Oxidoreductases Không đòi hỏi đồng cơ chất Oxi hóa/khử đối với –CH–OH, –C=O, –C=C, … EC 2 Transferases Không đòi hỏi đồng yếu tố Chuyển các nhóm chức như halogen, aldehyde, keto, acyl, glycosyl, … EC 3 Hydrolases Không đòi hỏi đồng yếu tố Thủy phân/ngưng tụ các ester, glycosid, nitril, amid, halogen, … EC 4 Lyases Không đòi hỏi đồng yếu tố Thêm/loại bỏ; cắt các liên kết C–C, C–O, C–N EC 5 Isomerases Không đòi hỏi đồng yếu tố Đồng phân hóa, chuyển dạng cis-trans, epime hóa EC 6 Ligases Cần đồng cơ chất ATP Tạo các liên kết C–O, C–S, C–N, C–C Một số vấn đề công nghệ  Chi phí cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn định hoặc hoạt tính.  Giảm thiểu sự mất hoạt tính trong quá trình cố định.  Khi enzym được cố định bằng phương pháp có tính thuận nghịch, sự rò rỉ enzym phải được nghiên cứu và có biện pháp thích hợp.  Sự giới hạn về luân chuyển vật chất trong chất mang cần được tính toán khi điều chỉnh pH hay nhiệt độ trong quá trình phản ứng.  Với enzym tự do, hoạt tính chuyển hóa có thể đạt được cao hơn ở nồng độ enzym cao, do đó việc chuyển hóa các cơ chất khó có thể thực hiện được.  Tính vô trùng của phản ứng cần được quan tâm.  Sự tương thích của dung môi với chất mang và ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính cần được xem xét. Lựa chọn nồi phản ứng * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * a b c f e d A: vận hành theo lô; B: vận hành theo lô có tuần hoàn; C: thùng khuấy có siêu lọc; D: thùng khuấy vận hành liên tục; E: thùng nhồi liên tục; F: tầng sôi liên tục Oxidoreductase N N N N HN ClO OHHO HO Ph Ph N N N N HN ClO OHHO HO Ph Ph ONucleoside Oxidase H2O, pH 6, 25 oC, 12-24h 5' Nucleoside oxidase lấy từ Stenotrophomonas maltophilia (FERM BP-2252) Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic acid của các nucleoside đồng đẳng. Enzym thô từ dịch chiết tế bào Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C Lipase O OH O N N N N F F O O N N N N F F OAc O OH O N N N N F F OH COOH OH N N N N F F O OH O N N N N F F Lipase 37oC, 20h Lipase H2O racemic (S)-acetat (R) (S) + Thuốc hạ cholesterol Lipase OO O O OO O O OO OH OO O N + Lipase H2O, 25 oC, 4h racemic cis-hexanoate (3R,4S)-phenol (-)-Ormeloxifene Thuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần) Lipase N H O CO2Et F N H O CO2H F N H O CO2Et F N H F O O O + Lipase pH 7, MeCN 45oC, 24h Paroxetine Thuốc chống trầm cảm Lipase CH3 O OH Novozym 435 CH3 O OH CH3 O OC12H25 (S)-(+)-ibuprofen (R)-(-)-ibuprofen ester + (R,S)-ibuprofen 1-Dodecanol Thuốc kháng viêm không steroid Amidase NH O NH O NH3 + OO- N HO N NH N NH2 OH -lactamase H2O, 70 oC + Carbovir rac-lactam (+)-lactam (-)-acid amin Đồng đẳng Carbovir Thuốc kháng HIV Deaminase N N O S NH2 O HO N N O S NH2 O HO N NH O S O O HO + Cytidine Deaminase H2O, pH 7, 32 oC, 35-70h Lamivudine Thuốc kháng virus (HBV, HIV) Lyase N CN N CONH2 H2O, pH 8, 25 oC, 18h Nicotinamide Tế bào R. rhodochrous J1 cố định Vitamin B3