Công nghệ enzyme và protein

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC –— BÀI BÁO CÁO CÔNG NGHỆ ENZYME VÀ PROTEIN GVHD: CN. ĐỖ THỊ TUYẾN SVTH: THỜI THỊ BÍCH NGA TP.HCM, tháng 04 năm 2011 MỤC LỤC BÀI1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD Thu nhận chế phẩm enzyme cellulose thô. Thực hành. Cân 5 g CPE cho vào cốc và tách bằng nước với tỉ lệ là 1:5, tức 5 g + 25 ml nước cất. Khuấy đều trong thời gian 30 phút. Lọc lấy dịch chiết và được thể tích là 21 ml. Tủa bằng cồn lạnh với tỷ lệ 1:3, tức 21 ml dịch chiết + 63 ml cồn lạnh. Cho hỗn hợp dung dịch trên vào bình erlen và giữ lạnh 30 phút. Tách lấy phần tủa ở phần dưới bình với thể tích là 25 ml và cho vào ống ly tâm 50 ml. Đem cân phân tích được 33.4 g. Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút. Tách lấy protein tủa, giữ lạnh để xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trước sắc ký. Kết quả. Hình 1: Dịch chiết trong bình erlen Hình 2: Dịch tủa protein trong ống ly tâm 50 ml Dựng đường protein chuẩn. Thực hành. Hóa chất Dung dịch mẫu protein, cụ thể trong bài này là mẫu enzyme cellulose cần xác định. Dung dịch albumin 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumine pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dich albumine có nồng độ 0,01mg/ml. Dung dịch thuốc thử Bradford : Coomassie Brilliant blue : 0,001g Ethanl tuyệt đối 4,7g Acid photphoric 85%: 8,5g. Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid photphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Thiết bị : máy quang phổ. Lập đồ thị chuẩn. Để dung dich albumine chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau: Dựng đường chuẩn protein( Albumine): Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5 Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50 V(ml) albumin 0 1 1 1 1 1 H2O (ml) 1 0 0 0 0 0 Thuốc thử Coomassie 2 2 2 2 2 2 Kết quả. Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ phải sang trái ta thấy: ống đối chứng có màu xanh nhạt nhất, và các ống thí nghiệm từ ống số 1 đến ống số 5 có màu xanh đậm dần như hình 3. Hình 3: Kết quả so màu. Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm: Số ống Đối chứng 1 2 3 4 5 OD 0 0.088 0.131 0.161 0.188 0.209 Dựng đường protein chuẩn. Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595 nm, ta dựng được đường protein chuẩn như sau: Nhận xét kết quả: Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì màu xanh càng đậm. Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ albumin càng cao thì chỉ số OD càng cao. Dựng đường chuẩn của đường glucose. Thực hành. Hóa chất Cồn 960C Sodium acetate Acid acetic 1M Cơ chất Dung dich cơ chất CMC pH5 Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS) Dung dịch lactose Dung dịch DNS-lactose Dung dịch enzyme Dụng cụ và thiết bị Máy ly tâm. Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. Bếp điện. Chậu nước lạnh. Que khuấy thủy tinh. Lập đồ thị chuẩn Hòa tan 100 ml glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm. Ống số ĐC 1 2 3 4 5 Nộng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 ml dd CMC pH5 1 1 1 1 1 1 ml dd DNS-lactose 2 2 2 2 2 2 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng bằng chậu nước lạnh. Đặt độ hấp thụ của ống đối chứng ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm và ghi lại kết quả. Kết quả: Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng, các ống thí nghiệm có màu đỏ và đậm dần từ ống thí nghiệm số 1 đến ống thí nghiệm số 5 như hình 4. Hình 4: Kết quả so màu. Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm Ống số ĐC 1 2 3 4 5 OD 0 0.149 0.253 0.392 0.504 0.675 Dựng đường chuẩn đường glucose Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) đo ở bước sóng 540 nm, ta dựng được đường chuẩn đường glucose như sau: Nhận xét kết quả: Dựa vào kết quả so màu ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì màu đỏ càng đậm. Dựa vào kết quả đo độ hấp thụ (OD) ta thấy, nồng độ đường glucose càng cao, đồng thời thể tích đường glucose càng cao và thể tích nước cất càng giảm thì chỉ số OD càng cao. Bài 2: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Ảnh hưởng bởi nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme (300C – 700C) Nguyên tắc Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme, ở những nhiệt độ khác nhau là 300C, 400C, 500C, 600C, và 700C. Cho kết quả so màu và chỉ số OD, khác nhau ở bước sóng 540 nm. Thực hành Chuẩn bị 7 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng với enzyme, 5 ống có phản ứng với enzyme. Ống đối chứng : Hút 1 ml H2O cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Ống nghiệm không có phản ứng enzyme Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. 5 ống nghiệm có phản ứng enzyme, được đánh số từ 1 đến 5. Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 1 và ủ ở nhiệt độ phòng (300C) trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ phòng. Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 2 và ủ ở nhiệt độ 400C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ 400C. Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 3 và ủ ở nhiệt độ 500C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ 500C. Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 4 và ủ ở nhiệt độ 600C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ 600C. Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm 5 và ủ ở nhiệt độ 700C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở nhiệt độ 700C. Sau đó thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào 5 ống nghiệm chứa enzyme trên và lắc đều. Để phản ứng ở nhiệt độ thích hợp chính xác 10 phút. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Kết quả Quan sát bằng mắt thường, từ phải sang trái theo thứ tự lần lượt là: ống đối chứng và ống không phản ứng có màu vàng, từ ống thí nghiệm số 1 ở 300C đến ống nghiệm số 4 ở 600C màu đỏ đậm dần, và ống nghiệm số 5 ở 700C màu đỏ nhạt dần như hình 5. Hình 5: Kết quả so màu. Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540 nm là: Số ống ĐC KPƯ 300C 400C 500C 600C 700C OD 0 0.232 1.15 1.431 1.55 1.568 1.515 Tính toán kết quả Dựa vào chỉ số OD ở các nhiệt độ khác nhau 300C,400C, 500C, 600C, 700C và chỉ số OD của ống không phản ứng, ta tính được chỉ số OD lần lượt là: OD30 = 0.918 OD40 = 1.199 OD50 = 1.138 OD60 =1.336 OD70 = 1.285 Thế vào phương trình: y = 1.303x + 0.003 ta được: X30 Tương tự cách tính trên ta được: X40 = 0.92 X50 = 0.87 X60= 1.023 X70= 0.98 Mặt khác ta có phương trình : U= ( At – A0)*F * Thế x vào phương trình U ta được: U30 = 0.702*0.75* U40 = 153.4 U50 =199.9 U60 = 222.7 U70 = 213.8 Vẽ đồ thị. Dựa vào chỉ số U và nhiệt độ ta vẽ được đồ thị: Biện luận sơ đồ: Dựa vào đồ thị ta thấy: Hoạt tính eyme đạt cực đại ở nhiệt độ 600C. Vì ở nhiệt độ này hoạt tính enzyme thủy phân tốt nhất. Ở nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 700C không đủ nhiệt độ cho enzyme thủy phân. Vì vậy hiệu suất thủy phân giảm. Ở nhiệt độ 700C thì enzyme dần dần bị biến tính nên hiệu suất thủy phân giảm dần. Đánh giá kết quả: Dựa vào kết quả so màu ta thấy: Mẫu đối chứng có màu vàng là màu của thuốc thử DNS pha loãng với 1ml nước cất. Ống không phản ứng có màu vàng đậm, chứng tỏ ở đây hoạt tính enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC pH5. Ống có phản ứng với enzyme từ nhiệt độ 30, 40 và 50 0c có màu đỏ đậm dần theo thứ tự từ nhiệt độ 30, 40 đến 500C. Chứng tỏ nhiệt độ tăng dần từ 30, 40 đến 500C thì hoạt tính enzyme tăng dần. Ở nhiệt độ 600C màu đỏ đậm nhất, chứng tỏ ở nhiệt độ này hoạt tính enzyme hoạt động mạnh nhất. Enzyme thủy phân dung dịch CMC càng mạnh làm cho màu của dung dịch có màu đỏ đậm. Ở nhiệt độ 700C màu đỏ nhạt dần, chứng tỏ hoạt tính enzyme giảm dần. Vì nhiệt độ càng cao thì enzyme bị biến tính. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme ( pH3 – pH8 ) Nguyên tắc Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme cellulose, trong dung dịch các đệm Na-acetate có pH 3, 4, 5, 6, 7, 8. Cho kết quả so màu khác nhau ở bước sóng 540 nm. Thực hành Chuẩn bị 13 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 6 ống không phản ứng với enzyme và 6 ống có phản ứng với enzyme. Ống đối chứng : Hút 1 ml H2O cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dich DNS-Lastose và lắc đều. Thêm 1ml CMC pH5 vào ống nghiệm và lắc đều. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. 6 ống không phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6. Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào 6 ống nghiệm và đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme. Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose vào 6 ống nghiệm và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC pH3 vào ống nghiệm số 1 và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC pH4 vào ống nghiệm số 2 và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm số 3 và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC pH6 vào ống nghiệm số 4 và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC pH7 vào ống nghiệm số 5 và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC pH8 vào ống nghiệm số 6 và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. 6 ống phản ứng được đánh số thứ tự từ 1 đến 6. Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 400C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch: CMC pH3, CMC pH4, CMC pH5, CMC pH6, CMC pH7, CMC pH8, thích hợp ở 40 0C trong 10 phút. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH3 vào ống nghiệm 1 chứa enzyme và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH4 vào ống nghiệm 2 chứa enzyme và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm 3 chứa enzyme và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH6 vào ống nghiệm 4 chứa enzyme và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH7 vào ống nghiệm 5 chứa enzyme và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH8 vào ống nghiệm 6 chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose vào 6 ống nghiệm và lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đem đun sôi cách thủy tất cả 6 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Kết quả: Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng và 6 ống nghiệm không phản ứng với enzyme, từ ống số 1 đến ống số 2 có màu vàng đậm dần. Từ ống số 3 đến ống số 6 màu vàng nhạt dần như hình 6. Hình 6: Kết quả so màu của ống ĐC và 6 ống nghiệm không phản ứng. Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang phải ta thấy: ống đối chứng có màu vàng và 6 ống nghiệm có phản ứng với enzyme có màu đỏ. Từ ống số 1 ở pH3 đến ống số 2 ở pH4 màu đỏ đậm dần, từ ống số 3 ở pH5 đến ống số 6 ở pH8 màu đổ nhạt dần như hình 7. Hình 7: Kết quả so màu của ống đối chứng và 6 ống nghiệm có phản ứng. Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 540nm: Số ống nghiệm pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 Không phản ứng 0.453 0.394 0.315 0.398 0.372 0.391 Phản ứng 0.939 0.958 0.837 0.641 0.382 0.517 Tính toán kết quả. Dựa vào kết quả chỉ số OD và phương trình y = 1.303x + 0.003. Ta có: - Tại pH=3: DOD= 0.939 – 0.453 = 0.486 X1 = 0.486 - Tại pH=4: DOD= 0.958 – 0.394 =0.564 X2= 0.564 - Tại pH=5: DOD= 0.837- 0.398 =0.439 X3=0.492 - Tại pH = 6: DOD = 0.641-0.398=0.243 X4=0.3012 - Tại pH = 7: DOD = 0.382-0.372=0.01 X5=0.21 -Tại pH = 8: DOD = 0.517-0.391= 0.126 X6=0.126 Từ đó ta tính được: U1=81 U2=94 U3=82 U4=50.2 U5=35 U6=21 Vẽ sơ đồ: dựa vào chỉ số u và pH ta vẽ được sơ đồ sau: f. Biện luận sơ đồ: - Theo đồ thị trên, ở pH=4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất, mà pH tối ưu là pH có hoạt tính enzyme cao nhất. - Vượt quá pH tối ưu thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm. Vì vậy trong môi trường càng kiềm hay càng acid thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm. Xác định hàm lượng protein trước sắc ký. Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thục ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml,dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. Thực hành: Lấy tủa protein thu được ở bài 1, hòa trong đệm và pha loãng 100 lần, sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein trước sắc ký. Chuẩn bị 2 ống nghiệm gồm: 1 ống đối chứng và 1 ống thực nghiệm Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0. Hút 1 ml nước cất cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Ống thực nghiệm: phản ứng enzyme. Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Kết quả: Quan sát bằng mắt thường, theo thứ tự từ trái sang ta thấy, ống đối chứng có màu xanh nhạt và ống thực nghiệm có màu xanh như ở hình 8. Hình 8: Kết quả so màu Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có OD = 0.25 Tính toán kết quả thu được: Đường chuẩn protein có dạng y = Ax + B Ta có đường chuẩn protein là: y = 0.003x + 0.0657 Ta lại có: OD = 0.25 Suy ra: x = = 61.4 ( µg/ml ) Vì được pha loãng 100 lần nên: x = 61.4 (µg/ml)* 100 * 10 (ml) = 61400 ( µg ) = 61.4 (mg) Vậy tổng hàm lượng protein là: = 61.4 (mg) Xác định hoạt tính enzyme trước sắc ký. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulose ở pH5 và 400C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobeenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm. Thực hành: Lấy tủa protein thu được ở bài 1, hòa trong đệm và pha loãng 100 lần, sau đó tiến hành xác định hoạt tính enzyme trước sắc ký. Chuẩn bị 3 ống nghiệm: 1 ống đối chứng, 1 ống không phản ứng, 1 ống phản ứng. Ống nghiệm đối chứng: chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0. Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong cốc nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm. Ống nghiệm không có phản ứng enzyme Hút 1 ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose và lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một cốc nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước song 540 nm. Ống nghiệm có phản ứng enzyme. Hút 1 ml dung dich enzyme cho vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 400C trong 10 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa dung dịch CMC pH5 thích hợp ở 40 0C trong 10 phút. Thêm 1 ml dung dịch CMC pH5 vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lastose và lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một cốc nước lạnh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Kết quả: Quan sát bằng mắt thường ta thấy: ống đối chứng có màu vàng là màu của dung dịch DNS-lastose pha loãng với 1 ml nước cất. Ống không có phản ứng có màu vàng là màu vàng của DNS-lastose, chứng tỏ ở đây enzyme bị bất hoạt nên không xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC pH5. Ống có phản ứng có màu đỏ, chứng tỏ ở đây có xảy ra quá trình thủy phân giữa enzyme và dung dịch CMC pH5, như hình 9. Hình 9: Kết quả so màu Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm: + Ống không phản ứng có OD = 0.036 + Ống phản ứng có OD = 1.541 Tính toán kết quả thu được: Dựa vào phương trình: y = 1.303x + 0.003 Ta có: ODkpư = 0.036 ODpư = 1.541 Suy ra OD = 1.505 Ta có phương trình: u = At – A0 * F * * * * Tính F: F = = 0.75 Thay vào phương trình ta có: x = = 1.15 Thế vào phương trình u ta được: U = 1.15 * 0.75 * * * * 100 * 10 = 645.8 Vậy tổng hoạt tính của enzyme là: = 645.8 Ta có hoạt tính riêng là: Hoạt tính riêng = = = 10.52 Bài 3: SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADAX_G50 Bước đầu tinh sạch enzyme cellulose bằng sắc ký lọc gel. Nguyên tắc Kỷ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chaamjqua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Thực hành Dụng cụ và thiết bị Phễu đổ gel Bình hút chân không Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30*1.5 cm, thể tích: 53 ml. Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm 20 cái vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. Hóa chất Gel “Sephadex G-100”. Đệm Acetate 50 mM pH5, đuổi bọt khí để tách enzyme tốt hơn. Chuẩn bị gel Cân 5g gel “Sephadex G-100” khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm acetate 50Mm, pH 5.0 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm acetate pH 5.0 nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53*2=106 ml dung dịch đệm. Sau khi quá trình hydrat hóa xãy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình nút hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 phút-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel. Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90% - 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Gắn phiểu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bẩn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2-5cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel. Khi cột đã nạp đầy gel, khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đện với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị. Chuẩn bị mẫu Hòa tan hoàn toàn protein trong dung dịch đệm, sau đó tiến hành lọc. Vì mẫu chạy sắc ký phải sạch. Lọc mẫu qua milipore sẽ làm gia tăng độ bền /thời gian sử dụng của cột. c. Kết quả Hình 10: lọc gel. Kết quả đo độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 280 nm. Số ống 1 2 3 4 5 6 7 8 OD 0.013 0.03 0.05 0.021 0.017 0.019 0.018 0.016 Vẽ đồ thị: Dựa vào chỉ số OD ta vẽ được đồ thị sau: Trong 8 ống nghiệm trên ta lấy từ ống số 2 đến ống số 8, trộn chung lại để xác định hàm lượng protein sau sắc ký và họat tính enzeme sau sắc ký. Xác định hàm lượng protein sau sắc ký. Thực hành Chuẩn bị 2 ống nghiệm: 1 ống đối chứng và 1 ống thực nghiệm. Ống nghiệm đối chứng: chỉ quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0. Hút 1 ml nước cho vào ống nghiệm