Công nghệ nuôi cấy tế bào trần

3/24/2011 1 CHƢƠNG V. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (Protoplast) = tế bào đơn – vách Ứng dụng tế bào trần • Có khả năng tiếp nhận vật liệu “ngoại lai”: nhân, ti thể, lục lạp, plasmids, vi khuẩn và virus • Có khả năng tái sinh vách tế bào  Đối tượng lai tạo giống: lai cùng loài, lai khác loài, lai khác giới sinh vật. Ứng dụng tế bào trần • Nghiên cứu sự tổng hợp và phân hủy vách tế bào • Nghiên cứu hệ thống tế bào đơn Nuôi cấy tế bào trần 1) Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy; 2) Xử lý enzyme tạo tế bào trần; 3) Tách tế bào trần; 4) Xác định mật độ tế bào trần; 5) (Dung hợp tế bào trần) 6) Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần. 3/24/2011 2 1) Chọn và khử trùng mẫu cấy Khử trùng Xử lý thẩm thấu bằng manitol hay sorbitol 2) Xử lý enzyme • Xử lý cơ học 2) Xử lý enzyme • Xử lý enzyme cellulase, hemi-cellulase, pectinase, lignase 3) Tách tế bào trần 3) Tách tế bào trần 4) Xác định mật độ • Nhuộm bằng phẩm nhuộm fluorescein diacetate để đánh giá khả năng sống sót của protoplast 3/24/2011 3 4) Xác định mật độ • Đếm trên buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ 5) Dung hợp tế bào trần 6) Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần • Môi trường nuôi cấy thường chứa 13% manitol, auxin, cytokinin,… • Tái tạo vách tế bào • Phân chia tạo cụm tế bào Dung hợp tế bào trần và sự lai vô tính Các tế bào trần có thể dung hợp một cách tự nhiên trong quá trình cô lập Dung hợp tế bào trần và sự lai vô tính Nếu như những tế bào trần được cô lập từ các nguồn tế bào khác nhau mà được xử lý để dung hợp thì gọi là lai vô tính. 3/24/2011 4 Phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 1) Phương pháp xử lý cơ học 2) Phương pháp xử lý bằng nitrate sodium 3) Phương pháp xử lý bằng ion Ca2+ (pH cao) 4) Phương pháp xử lý bằng Polyethylene Glycol (PEG) 5) Phương pháp dung hợp bằng xung điện 1) Phƣơng pháp xử lý cơ học • Tế bào trần cô lập được gom lại cho nằm gần với nhau nhờ một dụng cụ cầm tay cực nhỏ và một micropipette. • Một phần của đầu micropipette được chận lại vì vậy các tế bào trần được giữ lại và được đẩy đi theo dòng chất lỏng. • Số lượng tế bào dung hợp nhờ phương pháp này rất thấp và vì vậy phương pháp này không thông dụng. 2) Phƣơng pháp xử lý bằng nitrate sodium • Tế bào trần cô lập được đặt trong hỗn hợp NaNO3 5,5% trong dung dịch sucrose 10%. Giữ ổn định trong nước ở 35ºC và sau đó đem đi ly tâm 200 vòng trong 5 phút. • Loại bỏ phần nổi và cho các cụm tế bào vào nước trong 30 phút. Trong suốt quá trình này, hầu hết các tế bào trần sẽ tiến hành dung hợp. Các cụm tế bào được gạn ra sẽ được đưa vào trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% NaNO3. 3) Phƣơng pháp xử lý bằng ion Ca2+ (pH cao) • Tế bào trần được ly tâm trong 3 phút ở tốc độ 50 vòng/phút trong môi trường cảm ứng sự dung hợp gồm có 0,5M manitol, 0,05M CaCl2.2H2O ở pH 10,5. • Các ống ly tâm có chứa tế bào trần được ngâm trong nước ở 37ºC trong 40-50 phút. Sau khi xử lý xong có khoảng 20- 50% tế bào trần được dung hợp. 4) Phƣơng pháp xử lý bằng Polyethylene Glycol (PEG) • Dung dịch PEG làm tăng sự kết dính của tế bào trần và cảm ứng sự dung hợp tế bào trần của một số loài thực vật. • Hút 1 ml dung dịch môi trường có chứa tế bào trần với mật độ thích hợp cho vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy có 1 ml dung dịch PEG 56%. Ống nghiệm được lắc trong 5 giây rồi sau đó để yên 10 phút. Tế bào trần sau đó được rửa vài lần để loại bỏ PEG rồi chuyển lại vào trong môi trường nuôi cấy. 4) Phƣơng pháp dung hợp bằng xung điện Electrofusion chambers Fusion electrodes Electrofusion apparatus 3/24/2011 5