Đề tài Thu nhận bromelin và papain

MỤC LỤC PHẦN I: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM THỰC VẬT Nguồn nguyên liệu thu nhận ezym trang 2 Phương pháp thu nhận enzym từ thực vật trang 3 Sơ đồ quy trình công nghệ trang 3 Thuyết minh quy trình trang 4 Những tiêu chuẩn tinh khiết của enzym trang 13 PHẦN II: THU NHẬN BROMELIN TỪ DỨA Tổng quan về enzym bromelin trang 15 Phương pháp thu nhận bromelin trang 21 Phương pháp tinh sạch bromelin trang 23 Phương pháp thẩm tích trang 23 Lọc qua gel sephadex trang 24 Phương pháp sắc kí trang 24 Ưng dụng trang 25 Chế phẩm bromelin thương mại trang 29 PHẦN III: THU NHẬN PAPAIN TỪ ĐU ĐỦ Tổng quan về enzym papain trang 30 Phương pháp thu nhận papain trang 35 Thu nhựa đu đủ trang 36 Thu nhận papain trang 38 Nghiên cứu phương pháp mới thu nhận papain trang 39 Phương pháp tinh sạch papain trang 40 Ưng dụng trang 41 Chế phẩm bromelin thương mại trang 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO trang 44 PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM THỰC VẬT NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN ENZYM [1]: Vì enzym là những chất không thể chế biến được bằng phương pháp tổng hợp hoá học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzym có trong tất cả các cơ quan, mô của động, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzym nhất là tách với quy mô công nghiệp một cách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành trong những trường hợp nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzym với hiệu suất cao. Trong tay con người có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Từ động vật: Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày, tim … những phế liệu của công nghiệp thịt – dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch tụy có chứa amilase, lipase, protese, ribonuclease và một số enzym khác. Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê nghé người ta thu chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein. Renin là chế phẩm enzym có giá trị lớn trong công nghiệp. Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân, protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzym không lớn lắm. Từ thực vật: Người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân như papain, bromelin, ficin. Đó là các protease thực vật. Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cách khuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấy khô nghiền nhỏ. Bromelin thu từ thân dứa. Sau khi hái quả người ta bỏ lá và ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép. Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus. Thực vật (malt đại mạch và các hạt nảy mầm khác) cũng là nguồn enzym có truyền thống được dùng trong công nghệ rượu, bia, bánh kẹo. Malt chủ yếu có chứa amylase hoạt động, còn các enzym thuỷ phân khác hoạt động yếu. Tuy thế, thu các chế phẩm enzym thuần khiết từ malt không phổ biến và không kinh tế, bởi lẽ khi tách enzym tinh khiết từ malt thì những chất không hoà tan quí giá (tinh bột, protid) sẽ không được sử dụng. Mặt khác, malt là nguyên liệu đắt tiền. Lượng enzym thu được từ thực vật là không lớn lắm so với lượng nhiên liệu tiêu hao. Từ vi sinh vật: Sau khi đã điểm qua các nguồn nguyên liệu động thực vật chính có thể từ đó chiết xuất các chế phẩm enzym, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu đó vì nguyên nhân nào khác (về công nghệ hay kinh tế...) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzym nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứa hẹn, vì dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzym sẽ khắc phục được những khó khăn và hạn chế trên. Ta có thể thu enzym từ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Đây là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất một lượng enzym lớn, việc thu chế phẩm dễ dàng bên cạnh đó enzym của vi sinh vật có hoạt tính mạnh. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [1], [2]: Quy trình công nghệ: Thuyết minh quy trình công nghệ: Phá vỡ tế bào Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân microxom, mitochrondri..…) của tế bào. Các phân tử enzym không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzym nội bào, trước hết cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp: Xay nhuyễn Nghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch …. Đồng hóa: dùng áp cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ đó làm giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà không làm biến tính chúng. Điều này cũng tạo thuận lợi khi ta sử dụng phương pháp siêu lọc để làm tinh sạch enzym. Sử dụng sóng siêu âm. Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine... Thu dịch enzym thô Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly. Tách enzym Có thể sử dụng nhiều phương pháp như: Phương pháp kết tủa enzym: Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương. Điều này làm cho cản trở sự kết tủa của chúng. Enzym có bản chất protein, do đó để kết tủa được enzym phải phá vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dung dịch enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp cho protein tủa xuống. Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ở nồng độ cao như ammonium sulphate. Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là: Nồng độ của ammonium sulphate. pH của dịch chiết. Nhiệt độ kết tủa. Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết. Phương pháp siêu lọc: Dung dịch enzym thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa nhiều tạp chất. Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ các chất có phân tử lượng thấp hơn protein enzym đồng thời cô đặc enzym. Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có chứa nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các loại polimer bền như fluoro polimer (FS), cellulose acetate (CA), polysulphone(GR)…. Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Ví dụ, cô đặc protein: dùng màng FS, GR, cô đặc enzym: dùng màng GR. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng. Ap suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm. Các kiểu siêu lọc: Kiểu một bước Thấm qua màn Chậu chứa PL2 PL1 Cô đặc Màng siêu lọc bơm Van Hình II.2c.1: Kiểu lọc một bước Kiểu lô: chất lỏng chảy tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu. Thấm qua màng Thể tích đầu PL2 PL1 Chậu chứa Thể tích cuối Cô đặc màng siêu lọc van bơm Hình II.2c.2: Kiểu lô Kiểu thể tích không đổi: dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng tuần hoàn qua màn đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu. Màng siêu lọc Cô đặc Thể tích không đổi Chậu chứa van PL2 PL11 Thấm qua màng bơm Hình II.2c.3: Kiểu thể tích không đổi Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc: Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể. Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính. Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym. Trong quá trình thực hiện nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzym, do đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất mà không làm mất hoạt tính enzym càng cao. Trong quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC). Phương pháp hấp phụ: Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịch enzym) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch enzym. Hấp phụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong 2 cách – chất hấp phụ protein tạp hoặc chất hấp phụ enzym. Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC. Enzym sau đó được chiết sau đó bằng các dung môi thích hợp. Tinh sạch Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài. Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính enzym, cần tiến hành nhanh quá trình trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các chất gây biến tính. Bốn phương pháp chính và cổ điển thường được áp dụng khi tinh chế enzym là: Hấp phụ trên gel Phương pháp thẩm tích Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose) Kết tủa phân đoạn Kết tủa bằng dung môi hữu cơ Để tinh chế enzym một cách hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Phương pháp hấp phụ có chọn lọc: Đây là một trong những phương pháp tinh chế enzym quan trọng và thành công nhất, thường được dùng để làm đặc dung dịch enzym. Nguyên tắc: cho dịch enzym chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Tùy theo khả năng tương tác của các chất hấp phụ với từng loại enzym, các enzym khác nhau sẽ được hấp phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút enzym ra khỏi cột. Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách: Hấp phụ âm tính: dùng chất hấp phụ để tách tạp chất ra khỏi dung dịch enzym. Hấp phụ dương tính: enzym được hấp phụ và được tách ra khỏi những cấu tử khác trong dung dịch, sau đó được rửa giải khỏi chất hấp phụ bởi dung dịch đệm pH kiềm hoặc các dung dịch đệm khác có khả năng rửa giải enzym. Sau khi ly tâm để loại các hợp chất không tan, dung dịch enzym có thể được thẩm tách để loại dung dịch đệm. Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau: Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%. Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1 Môi trường hơi acid, pH = 5 - 6 Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại của bất kì một lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ. Vì thế một lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả mong muốn. Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0oC trong lúc trộn dung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng. Đây là một phương pháp nhanh, sự cân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịch hình thành rất sớm và chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ. Quá trình được tiến hành tuần tự như sau: Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp. Trộn đều Quay lắng Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào. Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụ phải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy đi khoảng 10% enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại 10% enzym trong dung dịch. Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ. Nếu enzym không được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâm lại. Trong sản xuất, để gel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải có cánh khuấy với tốc độ cao. Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịch đệm base nhẹ (pH = 7,6). Quá trình càng hiệu quả với dung dịch (NH4)2SO4 10%. Thể tích dung dịch rửa giải không nên quá lớn, thường là ít hơn thể tích gel ly tâm. Tốt hơn nên tiến hành rửa giải nhiều lần với thể tích nhỏ hơn là một lần với một lượng lớn. Phương pháp thẩm tích Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịch đệm ban đầu. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách: trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm trên. Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu có thể thì nên thay dung dịch đệm bên ngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ. Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ. Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym. Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính của enzym do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp. Cột sắc ký: Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinh khiết. Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử. Nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá trình trên. Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm với cột trao đổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải (grdient muối) với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi cột các enzym vừa liên kết với nhựa. Khi đó enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất. Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặc biệt là amberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose như diethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC). Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được hiệu quả tốt đối với những enzym có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm đẳng điện trong vùng kiềm, đồng thời việc rửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặp không ít khó khăn. Vì thế DEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi hơn do có khả năng loại bỏ được các tạp chất acid nucleic. Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau: Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một lần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein. Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích của nó lúc đưa vào cột. Trên các cột chứa sephadex G-75, G-100, G-200 đồng thời xảy ra sự phân tách từng phần các protein tùy theo phân tử lượng của chúng. Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải. Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết với nhựa. Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau: Tăng nồng độ các dung dịch đệm. Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch. Thay đổi pH của dung dịch tách. Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạn chứa enzym cần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làm khô) bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp. Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợp protein và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa. Nhờ đó, người ta đã loại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩm enzym thuần nhất về điện ly. Điện di: Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym và cũng là phương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein. Gần đây, phương pháp này được áp dụng ở những giai đoạn tinh chế enzym cuối cùng. Nguyên tắc: Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base. Nếu các phân tử protein enzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương) thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển trong điện trường ở những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt. Những phân đoạn enzym thu được được xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ. Kết tinh: Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh. Tuy nhiên, kết tinh không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết. Hoạt độ riêng của tinh thể tăng khi các enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần cho đến khi hoạt độ riêng tăng đến một giá trị cao nhất, không tăng được nữa. Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như là một phương pháp phân đoạn protein có giá trị. Vì thế, tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sử dụng ở những giai đoạn tinh thể cuối cùng. Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium sulfat. Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc tuần. Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch enzym đậm đặc cho đến khi bắt đầu thấy đục rõ. Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm tích ( trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩm tích đối với dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giản được làm bay hơi chậm. Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vài ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muốn. Khi thêm nồng độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình. Ngoài ra cần thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh. Thay vào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ muối xác định bằng cách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ. Nếu trước khi kết tinh mà thấy dung dịch enzym loãng thìa cần cô đặc dung dịch trước. Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là quá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ. Những tinh thể lắng xuống đựơc tách riêng và được tái kết tinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng. Sự tái kết tinh được làm đi làm lại nhiều lần cho tới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa. Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế: Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phân đoạn khác nhau phải được xác định. Trình tự hiệu quả nhất được xác định thông qua thực nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm sau: Hiển nhiên quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng. Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng một phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá những lượng lớn dịch chiết ban đầu. Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặc kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên, khi đó ta có những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng tách riêng protein tủa xuống. Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên aluminum hydroxide hoặc calcium phosphate. Những tủa thu được khi đó dễ tách biệt bằng cách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ. Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích do enzym rất kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thông thường nhất (trừ khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế có trong nước như Cu. Enzym thường có ái lực cao đối với những enzym này ngay cả khi nồng độ của chúng trong nước rất thấp. Điều này không quá nghiêm trọng đối với các chế phẩm thô như trong các giai đoạn sau này. Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích. Cột chứa jela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn