Đề tài Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. TRẦN KIM QUI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009 LỜI CẢM ƠN  Để hoàn thành chƣơng trình cao học và luận văn này, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn này. Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thời gian em thực hiện luận văn này. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã cho con có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1 TỔNG QUAN ................................................................................... 2 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN ...................................................... 2 1.1.1 Cysteine protease ................................................................................. 2 1.1.2 Papain .................................................................................................... 2 1.1.2.1 Nguồn gốc ....................................................................................... 2 1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ. .......................................................... 3 1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. ............................................ 4 1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ ................................................................................................. 4 1.1.2.2 Tính chất của papain ..................................................................... 5 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý ......................................................................... 5 1.1.2.2.2 Tính chất hóa học ..................................................................... 5 a) Cấu tạo hóa học ........................................................................... 5 b) Cấu trúc không gian ..................................................................... 6 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain ............................................. 7 d) Phản ứng của papain ................................................................... 7 e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain ................ 9 1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain ................................................. 10 1.1.2.3.1 Trong y học: ....................................................................... 10 1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: .......................................... 10 1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: .................................. 10 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ................ 10 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ........................... 12 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân ............................................................ 12 1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân ............................................ 13 1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: ............................. 14 1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân ............................................... 14 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: ...................................... 15 1.3.5.1 Ƣu điểm: ........................................................................................... 15 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: ..................................................................................... 15 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG .................... 15 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................ 17 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................................................ 17 2.1.1. Hóa chất ................................................................................................. 17 2.1.2. Thiết bị ................................................................................................... 18 2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN ................................................................... 18 2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái................................................. 18 2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết ............................................ 19 2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9. ................................................ 20 2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate ................................. 20 2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl ..................................................... 20 2.2.2.4 Kết tinh .............................................................................................. 20 2.2.2.5 Tái kết tinh ........................................................................................ 21 2.2.2.6 Đông khô chân không. ..................................................................... 21 2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry ............................. 22 2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson ........................ 23 2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl ............................ 24 2.2.5.1 Nguyên tắc: ...................................................................................... 24 2.2.5.2 Cách tính: ......................................................................................... 24 2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) .......... 25 2.2.6.1 Nguyên tắc........................................................................................ 25 2.2.6.2 Tiến hành ......................................................................................... 25 2.2.6.3 Cách tính .......................................................................................... 26 2.2.7 Xác định đạm amoniac .......................................................................... 26 2.2.7.1 Nguyên tắc........................................................................................ 26 2.2.7.2 Tiến hành ......................................................................................... 27 2.2.7.3 Cách tính .......................................................................................... 27 2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thô. ........................................................................ 27 2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: .................................................................... 27 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng ................................................. 27 2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân ........................................................................ 28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 30 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ ........................................... 30 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI ..................................... 30 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ ....... 31 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN ....... 33 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE ........ 34 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. .......................................................................................................... 35 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ ........................................................................................................... 37 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN .................................. 39 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN. ........................................................................................... 41 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. ............................................................................................ 44 3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH ............................................................... 44 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ ....................................................... 45 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. ......................................... 46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. ......................................................................... 49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất .................................................................................................... 65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất .................................................................................................... 72 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain .......................................................................... 5 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng .................................................... 10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ...................................... 11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ................................... 11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng ................................................. 11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. ..... 30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ ..................................................... 30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ...................................... 33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................ 34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. ................. 36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế ....................... 38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian .............................. 40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian .................................. 42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH ......................................... 44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ...... 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 54 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. ......................................... 46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. ......................................................................... 49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian............................................................................ 57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất .................................................................................................... 65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất .................................................................................................... 72 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain .......................................................................... 5 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng .................................................... 10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ...................................... 11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ................................... 11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng ................................................. 11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. ..... 30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ ..................................................... 30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ...................................... 33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................ 34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. ................. 36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế ....................... 38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian .............................. 40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian .................................. 42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH ......................................... 44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ...... 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. ........................................................................................................... 47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 54 Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 55 Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 56 Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% ..... 56 Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 58 Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 59 Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 59 Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 60 Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 61 Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 61 Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 62 Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 63 Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% ..... 63 Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 65 Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 66 Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 66 Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 68 Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 68 Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 69 Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 70 Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 70 Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% ..... 71 Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 72 Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 73 Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 74 Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 75 Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 75 Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 76 Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 77 Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 77 Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% ..... 78 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1. Các