Enzyme giới hạn và hệ thống hạn chế - Cải biên (Restriction modification system)

Enzyme giới hạn và hệ thống hạn chế - cải biên (Restriction modification system) Vào năm 1962, lần đầu tiên Werner Arber đã chứng minh rằng: Có những enzyme đặc biệt, hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân biệt DNA của mình và DNA lạ của phage. Các enzyme này hạn chế khả năng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách đặc hiệu. Vào năm 1970, Hamilton Smith phát hiện ở vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd enzyme giới hạn và đặt tên cho nó HindII. Với những thí nghiệm tiếp theo, Arber và cộng sự tại trường Đại học Geneva đã phát hiện ra nhiều chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ được DNA từ loài khác xâm nhập vào chúng nhờ kết hợp của hai quá trình enzyme. Hai quá trình enzyme được thống nhất trong một hệ thống gọi là hệ thống hạn chế - cải biến, nhằm phân hủy DNA lạ và bảo vệ DNA của mình. - Sự hạn chế được thực hiện nhờ sự hoạt động của các enzyme cắt hạn chế (RE - Rectriction Enzyme). Đó chính là các endodesoxyribonuclease đặc biệt có thể nhận biết một trình tự nucleotide đặc hiệu trong chuỗi DNA sợi đôi và cắt cả hai sợi DNA đó. - Sự cải biến là sự thay đổi DNA của bản thân tế bào theo con đường đặc biệt của mỗi loài, khiến DNA đó khác với DNA của loài khác và không phải là cơ chất của enzyme cắt hạn chế. Nhờ đó mà DNA của tế bào chủ được bảo vệ. Sự cải biên được thực hiện nhờ các enzyme metylase (mêtyl hoá) có trong tế bào vi khuẩn. Enzyme này sẽ metyl hoá cytosine ở vị trí (C5) và adenine (trên N của C6) thuộc vùng giới hạn (chuỗi đích). Ví dụ: Ở Enzyme Hind III, sau khi được metyl hoá (dấu chấm) ở adeninee, chuỗi đích này không được nhận biết bởi enzyme Hind III nữa, do đó, DNA không bị cắt: Vậy enzyme hạn chế và enzyme cải biên có cùng một đối tựơng nhận biết là chuỗi nucleotide đặc hiệu trong DNA ngoại lai và DNA của tế bào chủ, nhằm hạn chế sự sinh sản của DNA ngoại lai và bảo vệ DNA của mình. Tuy nhiên, cũng có một số loại enzyme có cả hai chức năng hạn chế và cải biên. Ví dụ: Enzyme EcoRI với chuỗi đích là: Tính đặc hiệu vị trí của enzim cắt giới hạn - RE - Rectriction Enzyme Rectriction Enzyme loại II bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. 1- Trình tự nhận biết của RE: Có thể nói các RE này là những công cụ thực thụ để cắt các DNA. Sự cắt này xảy ra ở một vùng đặc biệt được nhận biết bởi enzyme. Mỗi một enzyme nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu đối với nó và được gọi là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi. Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi bazơ. Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung sau: 2- Các kiểu cắt của RE: Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại. Ví dụ: HpaI Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai đầu lệch nhau một vài bazơ. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại. Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính bổ sung giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo ra những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền. Ví dụ: EcoRI 3- Số lượng đoạn cắt: Một RE có khả năng thao tác trên toàn bộ chiều dài của một phân tử DNA. Số lượng đoạn cắt phụ thuộc vào số chuỗi đích của một RE có trên phân tử DNA mà nó thao tác. Sử dụng RE khác nhau, sẽ bị cắt khác nhau và tạo ra lượng đoạn cắt khác nhau. Ví dụ: EcoRI Nếu chuỗi này có 5 lần trong một phân tử DNA thì enzyme EcoRI sẽ cắt tại 5 điểm trên phân tử DNA đó: - Ta sẽ được 5 đoạn nếu DNA dạng vòng - Ta sẽ được 6 đoạn nếu DNA dạng thẳng 4- Kích thước đoạn cắt: Vì vùng giới hạn được phân bố một cách ngẫu nhiên dọc theo một phân tử DNA mà được tạo thành bằng cách tổ hợp 4 loại bazơ nitơ (A,T,C,G) nên kích thước mỗi đoạn cắt phụ thuộc số cặp bazơ của mỗi chuỗi đích. Nếu vùng nhận biết (chuỗi đích) của enzyme là 6 cặp bazơ sẽ sinh ra các đoạn có kích thước trung bình 46 = 4.096 bazơ ≈ 4,1kb. Nếu vùng nhận biết của enzyme là 4 cặp bazơ sẽ sinh ra các mảnh có kích thước là 44 = 256 bazơ ≈ 0,26kb. Tuy nhiên một số RE nhận biết các vùng rất hiếm gặp trong DNA. Ví dụ như NotI có chuỗi đích (GC\GGCCGC), khi cắt cho các mảnh có kích thước khoảng 1.000kb. PvuI có chuỗi đích (CGAT\CG) cho mảnh khoảng 300kb.