Giải trình tự gen

GIẢI TRèNH TỰ GEN Các phương pháp giải trình tự gen Có 2 phương pháp chính: Phương pháp hoá học Maxam – Gilbert: đây là phương pháp được sử dụng đầu tiên để xác định trình tự gen nhưng hiện nay không còn đựơc sử dụng phổ biến nữa. Phương pháp Enzyme Sanger 1. Phương pháp hoá học Maxam - Gilbert Walter Gilbert Nguyên lý Sử dụng các chất hoá học cắt đứt sợi DNA tại 1 loại nucleotide đặc hiệu Phân tử DNA kép được đánh dấu P32 tại đầu 5’ Tách rời 2 sợi đơn bằng nhiệt Xử lý hoá học sao cho chỉ có 1 loại nucleotide bị phá huỷ -> hàng loạt đoạn DNA có kích thước khác nhau được tạo thành (sử dụng các chất hoá học khác nhau phá huỷ 4 loại nucleotide bằng 4 phản ứng riêng biệt) Tiến hành điện di các đoạn DNA thu đựơc trên gel polyacrylamide, chỉ quan sát đựơc đoạn có gắn P32. Đoạn DNA ngắn nhất có đánh dấu phóng xạ sẽ chạy nhanh nhất dưới tác dụng của điện trường. Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên gel mà xác định trình tự các nucleotide. 5’- Treat with chemicals that specifically cleave at a certain base. 4 tubes G-rxn A>G -rxn T>C -rxn C-rxn 5’- 5’- 5’- C The reaction is done such that each strand is cleaved only once C T A G ddNTP Reaction Mix 3’ G C A T T C C A T A G G 5’ MAXAM-GILBERT CHEMICAL SEQUENCING Labeled strand (P32) C C Sequence is read directly autoradiograph of dried sequencing gel Phá huỷ các nucleotide Trong phương pháp này sử dụng 5 phản ứng cơ bản: Dimethylsulfate ở pH 8.0 sẽ làm thay đổi Guanine (G). Piperidine formate ở pH 2.0 sẽ phá vỡ cầu nối glycoside giữa deoxyribose với purine (G,A) Hydrazine: mở các vòng pyrimidine (C , T) Hydrazine khi có mặt1.5M NaCl chỉ có tác dụng đối với C 1.2N NaOH ở 900C sẽ phá huỷ A mạnh và C kém. Kết quả: Dimethylsulfate at pH 8.0 -----------> G Piperidine formate at pH 2.0 -------> G and A Hydrazine ------------------------------> C and T Hydrazine in 1.5 M NaCl -----------> C 1.2 N NaOH at 90 oC -----------------> A and C 5’GACGTACTTA3’ G G+A T+C C A>C 1.2 N NaOH at 90 oC A>C Hydrazine T+C Piperidine formate pH 2 G+A Dimethyl sulfate pH 8 G Hydrazine in 1.5 M NaCl C X X 5’ to 3’ Nhược điểm Hoá chất độc Cần một lượng lớn chất phóng xạ Thiếu sự tự động Đôi khi kết quả thu đựơc trên gel không chính xác 2. Phương pháp enzyme Sanger Fred Sanger Nguyên lý Sử dụng dideoxynucleotide không có nhóm OH ở vị trí 3’ trong phản ứng tổng hợp DNA => phương pháp dideoxy Phân tử DNA kép được đánh dấu P32 tại đầu 5 ’ Sợi đôi DNA bị biến tính thành hai sợi đơn và đựơc lai với mồi (dài vài chục nu, liện kết đựơc với 1 trong 2 mạch đơn) Tiến hành đồng thời 4 phản ứng riêng lẽ với 4 loại dideoxynucleotide khác nhau -> các sợi đơn DNA được tổng hợp có độ dài ngắn khác nhau Diện di 4 sản phẩm cùng lúc trên gel polyacrylamide Đọc kết quả. Dideoxy-Nucleotides O (P)-(P)-(P)- H Base dNTP ddNTP If a ddNTP is added to a growing DNA chain, the sequence is terminated, because another base can not be added OH Mồi Sequencing Phương pháp dideoxy cải tiến Phương pháp dideoxy có thể được cải tiến để thực hiện các phản ứng trong cùng một ống nghiệm. Lúc này, các ddNTP sẽ được đánh dấu bằng các phân tử phát huỳnh quang màu khác nhau Ưu điểm của phương pháp cải tiến Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tự động hoá. Giảm giá thành phản ứng Tăng tốc độ phản ứng => Nhiều trung tâm giải trình tự gen đã sử dụng phương pháp này và họ có thể đọc được hàng triệu bp mỗi ngày.