Khối phổ & LC-MS

KHỐI PHỔ & LC-MS Mass Spectrometry & LC-MS Phạm gia Huệ Hà nội 07-08-2009  Công cụ PT hay dùng nhất hiện nay.  Kỹ thuật cung cấp thông tin về: 1. Khối lượng và công thức phân tử 1 hợp chất 2. MS cùng với NMR và IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân tử 3. Thành phần định tính và định lượng của một hỗn hợp. 4. Máy MS chuyển các Phân tử thành các ion ở thể khí và tách chúng theo tỷ số m/z và ghi lại cường độ từng ion, cho một phổ khối. 5. PT được mẫu rất nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí của các chất PTL nhỏ cỡ (một số Da) tới các protein (cỡ trên 300 000 Da). (Dalton (Da) = amu) Khối phổ (MS) là gì? Khối phổ (MS) là gì? Nguyên lý cơ bản là • sự tạo thành các ion, • các ion này được tách hay lọc theo tỷ lệ m/z (khối lượng/điện tích) của chúng, • và được phát hiện. Các thành phần một máy MS Nguồn ion PT khối Detector ion Phổ Khối m/z Si gn al In te ns ity Nạp mẫu R L K Chân không cao Xử lý và lưu dữ liệu Tránh ion PT va chạm với các phân tử trong không khí C ư ờ ng đ ộ tín hi ệu 1. Nguồn ion hoá  Biến đổi chất PT, tạo thành các ion phân tử (molecule) và các ion mảnh (fragment)  Hai kỹ thuật chính hay dùng: • Bắn phá electron (Electron Impact - EI): tạo ion dùng chùm electron năng lượng cao: phương pháp “cứng” • Ion hoá hoá học (chemical ionization -CI) tạo ion thông qua phản ứng với các ion thuốc thử: phương pháp “mềm” • Ví dụ: Electron bắn phá methanol: tạo cation gốc methanol, một ion phân tử: CH3OH + 1 e-  CH3OH+. + 2 e- • Chỉ một số (~0.01%) phân tử chất PT (M) được ion hoá • Phần lớn các ion phân tử bị phá thành các mảnh nhỏ hơn (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏ hơn) 1.1. Bắn phá electron (EI) + + Sợi đốt Khu vực Gia tốc ion PT khối Chùm electron 1.1. Bắn phá electron (EI) Chỉ các mảnh tích điện được phát hiện M e- 2e- M+• Mẫu Cation gốc / Ion phân tử • • Bắn phá / ion hoá [Mẹ] 70 eV F1+• NF1 F2+ Mảnh cation gốc F2• [Mảnh Con] + Phân mảnh F1+ F1• Mảnh trung hoà + + Mảnh cation Mảnh cation Mảnh gốc Gốc Các LK dễ gãy là các LK yếu nhất, tạo các mảnh bền Phổ MS của pentobarbital, bắn phá bằng electron • Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết. • Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55, • Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M. • Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cường độ 100%) . Cường độ pic khác tính theo % của pic cơ bản. Pic cơ bản Molecular ion peak M+.Pic ion phân tử Khối lượng phân tử =226 1.2. Ion hoá học (CI) – PHƯƠNG PHÁP mềm • Tạo ít mảnh. • Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH4. • Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành các SP như CH5+ CH5+ là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH+, có nhiều trên phổ MS ion hoá hoá học dùng methan 3544 44 2 CHCHCHCH eCHeCH .. .       MHCHMCH 45 (M+1) peak Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì. Ít các pic của mảnh so với phổ EI Phổ ion hoá hoá học của pentobarbital Ion hoá Hoá học C ư ờ ng độ tư ơ ng đố i 2. Bộ Phân tích Khối • Trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt. • Phân loại: Bộ phân tích từ, Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole) Bộ phân tích bãy ion tứ cực (Ion trap) Bộ phân tích thời gian bay (TOF) •Sau đây là bộ phân tích từ m/z = B2r2e/2V Focused ion M+Ion M+ Ionizing voltage 2.1 Bộ phân tích từ Sample inlet Low vacuum Detector Magnetic field BFocusing slits Accelerating voltage V Where m = mass, e = electron charge, z = # of charges/ion r = radius of curvature Increase B Radius r zeB mV2r 2 Ion Beam Detector Magnetic Field 2.2 Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole) • Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều xác định có thể đi thẳng qua khoảng không đến detector. Trong khi đó. •Các ion khác không sẽ có quĩ đạo không ổn định, va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó. •Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector. 2.2 Bộ phân tích tứ cực Bẫy ion (Quadrupole Ion trap) • Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích khối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy • Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector. 2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba (Triple Quadrupole) Ba bộ tứ cực nối tiếp nhau: Ở Q1: Ở các ion được tách Ở Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như nitơ, argon, heli. Bộ Q2 tạo ra phân ly do va chạm chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions). Ở Q3: làm nhiệm vụ tách các ion con DetectorQ 1 2Q 3Q Độ phân giải của máy khối phổ • Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic có khối lượng gần nhau m1 và m2. Độ phân giải R là: R = m 2 / (m 2 - m 1) • Hai pic cạnh nhau đươc coi là đã tách riêng khi phần chồng lấp giữa hai pic đó nhỏ hơn 10% pic nhỏ. • Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000. • Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt các ion có khối lượng gần nhau. • Ví dụ: để phân biệt 2 ion có m1= 280,2881 và m2= 280,2768 máy MS cần có R= 25 000 2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight) Nguyên tắc: • Dùng bộ phận gia tốc ion đẩy ion bay tới detector, đo thời gian bay • Thời gian bay được chuẩn hóa theo tỷ lệ m/z 2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight) Ưu điểm: • Độ phân giải rất cao (>10.000) • Độ chính xác rất cao ( 2- 5 mDa) Ứng dụng: • Xác định chất mới (xác định công thức) • Yêu cầu xác định khối lượng chính xác • Xác định được tạp • Đo tỷ lệ các pic đồng vị Xác định tạp 3. Detector Nhân electron (electron multiplier): Tác động của một ion lên bề mặt các dynode khác để tạo ra các electron ngày càng nhiều electron. 1  106 (hình bên) Nhân quang (photomultiplier): Các electron tạo ra theo cách trên va chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon. Các photon này được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu WS 2005 Máy MS tứ cực chập 3 (Trip Quad) TSQ (Thermo) Waters Micromass Q-Tof Premier 1 2 3 4 Waters Micromass Q-Tof Premier 1. Phun: Z-spray sạch hơn 2. T-Wave = ion optics = ion guide: tạo thành hình ống hướng ion vào giữa, ít mất mát ion trên đường đi 3. T-Wave thứ hai: cho MS2 4. TOF: Lựa chọn V mode/ W mode GC-MS Tách bằng GC Xác định bằng MS Có thư viện phổ chuẩn Mass spectrometer acts as a detector for GC Interface LC-MS • Tách bằng LC Xác định bằng MS • Khó khăn: loại ảnh hưởng của dung môi và các thành phần trong pha động; không có thư viện phổ • Để ghép nối giữa LC và MS: • giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI (atmospheric pressure chemical ionisation) • giao diện phun điện ESI (electrospray) ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI • Nitơ được dùng để phun sương pha động tạo thành một sol khí hay khí dung (aerosol) của khí nitơ và các giọt nhỏ dung môi . • Sol khí này dược đưa qua một khu vực được đốt nóng. Ở đây dung môi bị loại và các chất được ion hoá nhờ các phản ứng ion-phân tử ở áp suất khí quyển, các electron và các ion sơ cấp được tạo ra do phóng điện. APCI: Atmospheric Chemical Ionization giao diện phun điện ES Các giọt dung dịch thu nhỏ và tăng điện tích. Các phân tử dung môi không tích điện bị loại Ion hóa bằng phun điện ESI (Electrospray Ionization) LC-MS • Tách bằng LC Xác định bằng MS • Khó khăn: loại ảnh hưởng của dung môi và các thành phần trong pha động; không có thư viện phổ • Để ghép nối giữa LC và MS: • giao diện ion hoá hoá học ở áp suất thường APCI (atmospheric pressure chemical ionisation) • giao diện phun điện ES (electrospray) Ví dụ Ứng dụng LC-MS • Phát hiện tạp chất trong các thuốc tổng hợp, • LC: pha động ACN-amoni ethanoat, C18 • giao diện phun điện. • Sắc đồ TIC: ion mẹ rửa giải ở phút thứ 17,7 và các pic tạp ra trước và sau đó. • • MS: Chất ra ở 8,35 ph cho phổ khối có các pic thuộc ion (M+H)+ xuất hiện ở m/z = 225 và 227 theo tỷ lệ 3:1 cho thấy sự có mặt của nguyên tử clo. Chất tạp là quinazolin có 3 nhóm thế. Ví dụ Ứng dụng LC-MS Sắc đồ TIC MS pic phút 8,35 Trình bày dữ liệu • Dạng TIC (Total Ion Chromatogram) • Dạng SIM (Single Ion Monitoring) m/z xác định Tất cả Tất cả Trình bày dữ liệu • Dạng TIC (Total Ion Chromatogram) • Dạng SIM (Single Ion Monitoring) • Dạng MRM (Multiple Reaction Monitoring) m/z xác địnhTất cảm/z xác định