Ki thuật di truyền

KI THUẬT DI TRUYỀN I/ Khái niệm kĩ thuật di truyền 1.Định nghĩa Kĩ thuật di truyền là kĩ thuật thao tác trên vật liệu di truyền dựa vào những hiểu biết về cấu trúc hoá học của các axit nuclêic và di truyền vi sinh vật. 2. Phương pháp Phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là kĩ thuật cấy gen, tức là chuyển một đoạn AND từ tế bào cho sang tế bào nhận bằng cách dùng plasmit làm thể truyền. II/ KỸ THUẬT CẤY GEN GEN (TẾ BÀOCHO) GEN (TẾ BÀONHẬN) Plasmit laø gì ? - Plasmit : Plasmit laø nhöõng caáu truùc naèm trong teá baøo chaát cuûa vi khuaån. Tuyø loaøi vi khuaån, moãi teá baøo chöùa töø vaøi plasmit ñeán vaøi chuïc plasmit. - Plasmit chöùa ADN daïng voøng, goàm khoaûng töø 8.000 – 200.000 caëp nucleâoâtit. ADN cuûa plasmit töï nhaân ñoâi ñoäc laäp vôùi ADN nhieãm saéc theå. 3. Caùc khaâu chuû yeáu cuûa kyõ thuaät caáy gen: Kĩ thuật cấy gen có 3 khâu chủ yếu: + Tách ADN nhiễm sắc thể của tế bào cho và tách plasmit ra khỏi tế bào. + Cắt và nối ADN của tế bào cho vào ADN plasmit ở những điểm xác định, tạo nên ADN tái tổ hợp. - Thao tác cắt tách đoạn ADN được thực hiện nhờ enzim cắt (restrictaza). Các phân tử enzim này nhận ra và cắt đứt ADN ở những nuclêôtit xác định nhờ đó người ta có thể tách các gen mã hoá những prôtêin nhất định. Việc cắt đứt ADN vòng của plasmit cũng được thực hiện do enzim cắt  còn việc ghép đoạn ADN của tế bào cho vào ADN plasmit thì do enzim nối (ligaza) đảm nhiệm. + Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận, tạo điều kiện cho gen đã ghép được biểu hiện. Plasmit mang ADN tái tổ hợp được chuyển vào tế bào nhận bằng nhiều phương pháp khác nhau. Vào tế bào nhận, nó tự nhân đôi, được truyền qua các thế hệ tế bào sau qua cơ chế phân bào và tổng hợp loại prôtêin đã mã hoá trong đoạn ADN được ghép. - Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột E.Coli. Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi. Sau 12 giờ, 1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit trong chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một lượng lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào plasmit. Tế bào nhận được dùng phổ biến là vi khuẩn đường ruột E.Coli. Tế bào E.Coli sau 30 phút lại tự nhân đôi. Sau 12 giờ, 1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 16 triệu tế bào, qua đó các plasmit trong chúng cũng được nhân lên rất nhanh và sản xuất ra một lượng lớn các chất tương ứng với các gen đã ghép vào plasmit. Trong kĩ thuật cấy gen người ta còn dùng thể thực khuẩn làm thể truyền. Nó gắn đoạn ADN của tế bào cho vào ADN của nó và trong khi xâm nhập vào tế bào nhận nó sẽ đem theo cả đoạn ADN này vào đó. KỸ THUẬT CẤY GEN ADN của tế bào nhận E.coli ADN Plasmit tái tổ hợp dạng vòng Tách ADN nhieãm saéc theå cuûa teá baøo cho,taùch plasmit ra khoûi teá baøo Cắt vaø nối ADN cuûa teá baøo cho vaø ADN plasmit ôû nhöõng ñieåm xaùc ñònh,taïo ADN taùi toå hôïp. * Caét: Enzim caét (restrictaza) * Noái: Enzim noái (ligaza) Chuyển ADN taùi tổ hợp vaøo tế baøo nhận, taïo ñieàu kieän cho gen ñaõ gheùp ñöôïc bieåu hieän . SƠ ĐỒ CẤY GEN NHỜ THEÅ THÖÏCKHUẨN III/ PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Nguyên tắc của phương pháp PCR: ADN polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ AND mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn AND ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % ADN mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự ADN, ADN polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn ADN nằm giữa 2 mồi. 2. Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng: - ADN bản mẫu - Mồi xuôi và mồi ngược - dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - MgCl2 - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…) - Dung dịch đệm. - Nước cất 2 lần (đã khử trùng) Các bước của phản ứng: Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturation) ADN được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C, trong thời gian 30s – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với ADN mạch khuôn là Ta (Ta thấp hơn Tm khoảng 50C). Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C, để ADN polymerase hoạt động kéo dài mạch. 3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ADN mẫu: - ADN sạch, lượng ADN sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm (khoảng 100 ng) - Giảm lượng mẫu  hạn chế sản phẩm “kí sinh”. - PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt. Enzyme : Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ Thermus aquaticus là Taq polymerase. Enzyme Pfu ADN polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease. Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có ADN và Mg2+ thì enzyme này thực hiện khuếch đại ADN. Mồi và nhiệt độ lai Ta - Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ sung giữa “mồi xuôi” và “mồi ngược”, khả năng tạo cấu trúc “kẹp tóc”. Tm của 2 mồi không cách biệt quá xa. Mồi đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại và không bắt cặp với trình tự khác trên gen. Các thành phần khác của phản ứng: dNTP: thường sử dụng ở nồng độ là 20 -200 µM đối với mỗi loại. Mg2+: quá ít  hiệu quả nhân bản giảm quá nhiều  tạo sản phẩm không đặc hiệu Số lượng chu kỳ: không vượt quá 40 4. Ứng dụng của phương pháp PCR Tạo số lượng lớn bản sao ADN  dòng hóa gene, giải trình tự, lập bản đồ di truyền, sản xuất mẫu dò… Biến đổi một trình tự ADN: thêm vị trí của enzyme cắt hạn chế, gây tạo đột biến trên ADN, thêm trình tự promoter, trình tự gắn của ribosome… 5. Hạn chế của phương pháp PCR Ngoại nhiễm: Xử lí: Khử trùng khu vực thao tác . Việc thiết lập phản ứng PCR và phân tích sản phẩm được tiến hành ở các khu vực khác nhau. Nhân bản không đặc hiệu: Các sai sót do Taq polymerase 5. Các dạng khác của PCR: RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cADN  ADN. RT – PCR (Realtime PCR – PCR định lượng): xác định hàm lượng sản phẩm PCR tạo ra ở từng thời điểm. Nguyên tắc: xác định hàm lượng sản phẩm dựa trên tín hiệu huỳnh quang. PCR nested: sử dụng nhiều hơn một cặp mồi  thu nhận sản phẩm đặc hiệu hơn. IV/ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT DI TRUYỀN Công nghệ sinh học (Biotechnology) sử dụng các tế bào sống để tạo ra các nguyên liệu hữu dụng cho con người: –Nấm nen được dùng sản xuất bia, rượu vang; vi khuẩn được dùng sản xuất cheese, yogurt, v.v... –Các vi khuẩn được dùng sản xuất các chất kháng sinh, rượu và một số sản phẩm khác • Nhiều loại dược phẩm đã được tạo ra nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN • Thí dụ: –TPA (tissue plasminogen activator) đang được sản xuất từ vi khuẩn E. coli nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN –TPA là một enzyme xúc tác sự biến đổi plasminogen trong máu thành plasmin. Plasmin là một protein có khả năng hòa tan cục máu (clot) Hết bài