Melamine đi vào chuỗi độc tính của nó (Melamine/Cyanuric Acid)

Melamine đi vào chuỗi thực phẩm và độc tính của nó (Melamine/Cyanuric Acid) PGS.TS. Dương Thanh Liêm Bộ môn Dinh dưỡng Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm Bản chất hóa học và mục tiêu sử dụng của melanine Bản chất hóa học: Melamine (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) là một base hữu cơ. Melamine có chứa 66% nitrogen; Urea chứa 46% Nitrogen; Protein chứa 16% Nitrogen. Mục tiêu sử dụng: Melamine được sử dụng để sản xuất ra melamine resin (polymer công nghiệp). Sản xuất keo dán gổ trong công nghiệp Sản xuất dụng cụ gia đình (cốc, kính mica, Ca nhựa…) Làm chất chậm cháy Dùng làm phân bón ở một số nước Đông Nam Á. Các dẫn xuất của Melamine ► Acid cyanuric 1,3,5-triazine-2,4,6-triol Acid cyanuric cũng là hóa chất được sản xuất với số lượng lớn ● Sản xuất thuốc diệt cỏ ● Sản xuất thuốc nhuộm ● Sản xuất chất dẽo ● Là chất chống khuẩn ● Là chất ổn định và tẩy uế nước trong các bể bơi Mục tiêu sử dụng của acid cyanuric: Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm? Con đường thứ nhất - Do ô nhiễm môi trường: Sử dụng dụng cụ có liên quan với chất dẽo để chế biến hoặc chứa đựng thực phẩm trong các hoàn cảnh nhiệt độ và pH khác nhau, có thể melamine từ dụng cụ đó đi vào thực phẩm, hoặc vào trong nước, rồi từ nước đi vào thực phẩm, với số lượng như là một vi chất. Con đường thứ hai - Do cố tình, gian lận: Đưa 1% melamine vào trong thực phẩm thì làm tăng lên 4,13% protein thô. Việc kiểm tra hàm lượng protein trong thực phẩm, chỉ kiểm tra protein thô, nên những nhà sản xuất gian lận lợi dụng điều này để làm mau đầy két tiền nhà mình và gây ra những cái chết đáng thương của một số trẻ thơ và hàng chục ngàn trẻ em Trung Quốc phải nhập viện để điều trị. Đây mới là con đường chính thống mà melamine đã đi vào chuỗi thực phẩm gây ngộ độc cho thú kiểng và người trên phạm vi Thế giới. Mùa xuân 2007 ● Đã gây chết nhiều mèo, chó với triệu chứng giống nhau, tất cả đều có sỏi hữu cơ trong thận. Ước tính có 1950 con mèo và 2200 con chó. ●Từ cái chết thú kiểng, người ta đã thu hồi tiêu hủy thức ăn bị nhiểm độc mua bán trên thị trường Quốc tế. ●Từ sự kiện này FDA bắt đầu nghiên cứu trên phạm vi rộng lớn, để đáp trả lại sự kiện nghiêm trọng này trong lịch sử. Câu trả lời là từ sự nhiễm độc “gluten lúa mì” và “protein gạo” do người ta đưa thêm melamine (melamine, cyanuric acid, ammeline, ammelide...) để tăng hàm lượng đạm thô trong thức ăn nguyên liệu này. ► Sự bùng nổ ngộ độc melamine trong thức ăn thú kiểng trên thế giới ► Nghiên cứu mô bệnh học trên thận mèo. Những tinh thể Melamine cyanurate trong thận (Xác định bởi kính hiển vi FTIR) Thương tổn trên ống lượn gần của thận. Ngộ độc thận cấp tính với những tinh thể sỏi hữu cơ melamine-cyanurate được lập lại thí nghiệm trên các loài động vật khi cho chúng ăn melamine và acid cyanuric: ● Mèo ● Chó ● Heo ● Chuột Tất cả đều có triệu chứng và cơ chế gây độc giống nhau. Hạt sỏi hữu cơ hình thành trong thận trẻ nhiễm độc chất Melamine Hạt sỏi melamine-cyanurate Nguồn tài liệu: ► Độc học của melamine và acid cyanuric Có rất nhiều nghiên cứu, cho thấy độc tính từng chất riêng lẻ rất thấp, với liều LD50 khảo sát được như sau: LD50 qua miệng, trên chuột trắng = 3.161 mg/kg LD50 qua miệng, chuột = 3.296 mg/kg LD50 qua da, trên thỏ > 1.000 mg/kg Với acid cyanuric LD50 qua miệng, chuột trắng > 10.000 mg/kg LD50 qua da, thỏ > 7.940 mg/kg Mức gây độc của từng chất riêng lẻ rất cao, có thể so sánh chúng với mức gây độc của muối ăn. Với Melamine Vì sao Melamine, acid cyanuric được hấp thu trong ống tiêu hóa lại gây độc hại cho cơ thể ở thận? - Melamine - 3240 mg/L - Cyanuric acid -2000 mg/L - Melamine-cyanurate - 2.2 mg/L Tác dụng cộng hưởng tăng độc tính Melamine, acid cyanuric hấp thu trong ống tiêu hóa Vào cơ thể phân bố khắp nơi Tạo ra melamine- cyanurate kết tủa ở thận ► Độc tính của Melamine + acid cyanuric Khả năng hòa tan trong nước: Melamine cyanurate Phản ứng tạo polymer không tan giữa melamine (màu xanh) và acid cyanuric (màu đỏ) Sự nhiễm melamine đầu tiên vào thức ăn thú kiểng, tiếp theo là vào thức ăn chăn nuôi, gần đây vào sữa bột cho người ở Trung Quốc. Các loài động vật ăn thức ăn nhiễm melamine đều có hại cho sức khỏe của chúng: ● Gia cầm ● Heo ● Các loài thủy sản nuôi trồng rồi “tuôn vào” chuổi thực phẩm của người Đánh giá nguy cơ của FDA ► Sự ô nhiễm melamine vào chuổi thực phẩm của người ● Tháng 5/ 2007 - Đánh giá nguy cơ/an toàn của Melamine và những dẫn xuất của nó, (CFSAN / FDA) “...tiêu thụ thịt heo, thịt gia cầm, các loài cá nuôi trồng, và trứng từ những động vật được nuôi dưỡng bằng thức ăn đã bị nhiễm melamine và những dẫn xuất của nó, đến nay vẫn chưa có bằng chứng chắc chắn sẽ gây nguy cơ sức khỏe cho người…” ► Đánh giá nguy cơ sức khỏe cho con người khi súc vật ăn thức ăn nhiễm melamine Những hiểu biết đến nay về độc tính của melamine chưa đầy đủ lắm, cần phải làm sáng tỏ trong những đánh giá được cập nhật tiếp theo trong tương lai. ● Sự nhiễm vào thực phẩm / thức ăn chăn nuôi Nhiều tài liệu ghi nhận có sự bùng nổ ngộ độc hư thận (nephrotoxicity) trên thú kiểng ở châu Á năm 2004 Cũng có những tài liệu ghi nhận có sự nhiễm melemine trong bột cá và bột thịt ở Italy trong thời gian 1979-1987 ●72% số mẫu kiểm tra dương tính, mức nhiễm trên 1.9% melamine (theo trọng lượng) Kiểm tra thức ăn công nghiệp của thú kiểng và người nhận thấy: ● Nhiễm melamine trong gluten nhưng không ghi trên nhãn ● Thức ăn cho những người ăn chay có chứa hàm lượng cao gluten ►Nguồn nhiễm tiềm ẩn vào thực phẩm (melamine / acid cyanuric) ● Nguồn nhiễm khác Một số polymer melamine ở mặt đáy dụng cụ nấu nướng có thể tách ra những phần melamine có ý nghĩa vào trong thực phẩm ● Từ dụng cụ này có thể làm tan khoảng 2.5 mg/100 cm2 khi nấu với thực phẩm có tính acid Acid cyanuric là một bộ phận hợp thành của biuret được FDA thừa nhận, đây lại là chất bổ sung NPN cho thú nhai lại (từ đây có thể chuyển hóa đưa đên trên 30% acid cyanuric và triuret. Acid cyanuric là chất dùng làm ổn định và tẩy uế bễ bơi ● Mức khuyến cáo 100 ppm (có thể cao hơn trong các bễ bơi quản lý tồi) ● Nước bễ bơi có thể vào bụng ước tính khoảng 154 mL (với trẻ em khi bơi trong bễ bơi) tương đương khoảng ~15.4 mg acid cyanuric. ► Melamine/acid cyanuric Nguồn nhiễm tiềm ẩn melamine trên người Sữa bột nhiễm độc Melamine ở Trung Quốc đã gây chết 6 em bé và 300.000 em bé khác nhiễm độc phải nhập viện Người ta cho melamine vào sữa bột để tăng lượng đạm của sữa. Theo Tân Hoa xã cho biết, Tập đoàn Sanlu Group Co., nhà sản xuất sữa bột lớn nhất Trung Quốc, đã thu hồi hàng trăm ngàn tấn sản phẩm của họ, sau khi hàng trăm em bé bị sỏi thận và một số em bị chết. Các xét nghiệm của Sanlu cho thấy sữa của họ nhiễm melamine, một loại hóa chất được dùng trong công nghệ chất dẻo. Các em bé bị trúng độc do sữa bột có chứa chất Melamine Linked Video clip Tình hình nhiểm độc melamine ở Việt nam Video clip Ảnh hưởng của melamin trong thức ăn chăn nuôi đến tình trạng sức khỏe vật nuôi Nguồn tài liệu: Assoc.Prof. Dr. Jowaman Khajarern Department of Animal Science, Khon Kaen University Khon Kaen, 40002. Thailand Trên gà thịt Bàn chân nổi những hạt ké Thận trương nở to ra Có hạt sỏi tinh thể trong thận Có sỏi kết tủa trong tinh hoàn Tinh thể sỏi trong thận Trên heo lớn Sỏi kết tinh dưới bàn chân heo Trên heo con Thận heo con bú sữa tổn thương Trong phân xuất hiện sỏi melamine-cyanurate Trên thận heo Thận bị tổn thương (bên phải) do các hạt sỏi gây ra Hạt sỏi melamine-cyanurate kết tủa trong thận Hạt sỏi còn kết tinh trong lớp mỡ ở thận heo Ruột cá bị sưng lên, da lở loét Trong ruộc cá da trơn (Catfish) có sỏi Vẩy cá đội lên do sỏi melamine-cyanurate melamine Tinh thể melamine tạo nên các đốm trên vỏ tôm. Tổ chức gan thận sưng to trên tôm Trong ống tiêu hóa của tôm viêm nổi lên các cục phồng to Hạt sỏi kết tinh trong ống tiêu hóa Ống sinh dục của tôm cũng bị sưng lên Tinh thể melamine-cyanurate trong ống sinh dục tôm Tích tụ hạt sỏi ngày càng lớn hơn trong ống tiêu hóa Độc lực của melamine trên động vật Liều gây chết 50% trên chuột qua miệng (LD50) là 3.161 mg/kg (OECE, 2002) Thí nghiệm ảnh hưởng melamine trên động vật qua miệng được thực hiện trên chó (in a dog study; OECD, 2002) cho thấy: Giảm tiêu thụ thức ăn Giảm trọng lượng có sỏi trong bàng quang Thương tổn thận, bàng quang Tỷ lệ sống rất thấp Phát triển các phương phápkiểm tra melamine Kiểm tra dưới kính hiển vi thức ăn nhiễm Melamine Melamine trong gluten lúa mì Mẫu kiểm tra nhiễm melamine Mẫu đối chứng không nhiễm melamine melamine Solution C (Test kit C) Test kit nầy chỉ sử dụng để xác định melamine Melamine = Phản ứng cho màu đỏ anh đào trong 1 phút. Test sàn lọc melamine Test chuẩn với 0.3% Solution C AQ UF MFy1-2 MFgr MUF1-2 NPN -ST Solution C cho phản ứng dương tính với melamine Màu đỏ anh đào = test dương tính chỉ cho melamine Phát triển phương pháp kiểm tra melamine trong thực phẩm bằng công cụ ELISA Các bước thao tác kiểm tra melamine trong thức ăn Pet Food www.romerlabes.com Link Video clip Kiểm tra melamine trong sữa, trứng bằng phương pháp ELISA  AgraQuant® Melamine Sensitive ELISA Test Kit The AgraQuant® Melamine Sensitive Test Kit do phòng thí nghiệm Romer Labs® là phương pháp cho kháng thể liên kết với enzyme EIA (enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Nó được nghiên cứu phát triển đặc biệt cho việc phân tích melamine trong sản phẩm sữa như: sữa, nước uống yogurt và sữa bột. AgraQuant® Melamine Sensitive Test Kit có thể định lượng được với mức biến động từ 0.10 - 5.00 mg/kg cho sữa, nước uống yogurt và 0.50-25 mg/kg cho sữa bột. Mỗi một kit có đầy đủ với chất chuẩn melamine, giếng được bọc kháng thể; kháng thể được kết hợp với enzyme, cơ chất và chất làm dừng (stop solution), v.v... AgraQuant® Melamine Sensitive Kit khá chính xác. Có thể thực hiện phương pháp thử lập lại; kết quả 2 lần thử phù hợp nhau có thể quan sát được. AgraQuant® Melamine Sensitive Kit thực hiện kiểm tra nhanh, cần có thời gian ủ ấm trong 50 phút. Chiết xuất mẫu đơn giản và không yêu cầu những bước làm sạch mẫu cao độ; thực hiện test thử mẫu dễ dàng. Một mâm gồm có 96 giếng thử nhỏ, tiêu hao hóa chất, nước rửa và thuốc thử ít, giá thành mẫu thử thấp. Link Video clips Sự phối hợp giữa kiểm tra sàn lọc và kiểm tra sâu sắc Kiểm tra sàn lọc: Sử dụng phương pháp ELISA (chọn lựa EIA test kit) có bán trên thị trường Thế giới. Ưu điểm của phương pháp: - Thực hiện nhanh (Âm tính là không có, dương tính có thể có, có thể không) - Độ phát hiện nhạy với hàm lượng pbb (định lượng không chính xác) Kiểm tra sâu: Sử dụng phương pháp sắc ký khối phổ. Nếu có kinh nghiệm thì chính xác, thiết bị đắt tiền, giá thành kiểm tra mẫu cao. Phương pháp phân tích melamine được đề nghị chính thức bởi EC trong các nước thành viên để kiểm tra nguồn thức ăn giàu protein Diagram sắc ký với các dẫn xuất hóa học của Melamine cyanuric acid ammelide ammeline melamine benzoguanamine Bộ Y tế VN qui định ngưỡng melamine nhiễm chéo trong thực phẩm Ngày 12/12, Bộ Y tế đã ban hành quyết định số 38/2008/QĐ-BYT về “Quy định mức giới hạn tối đa của melamin nhiễm chéo trong thực phẩm”. Bộ Y tế đã chấp nhận ngưỡng melamine trong thực phẩm dành cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi không vượt quá 1mg/kg thực phẩm; các loại thực phẩm khác không vượt quá 2,5mg/kg thực phẩm. Giới hạn này sẽ được thay đổi khi có cơ sở khoa học về độc tính của melamine và các chất liên quan được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc (FAO) công bố bổ sung. Hiện tại WHO qui định mức nhiễm tối đa cho phép 0,2 mg/kg thể trọng. ► Chìa khóa cho những nghiên cứu bổ sung thêm để đánh giá về độc tính của melamine / acid cyanuric Cần phải có sự kết hợp trong những nghiên cứu tiếp theo với các vấn đề sau đây: ● Nghiên cứu để hiểu biết tốt hơn tác dụng về hóa học của melamine; ●Đánh giá độc tính khi phối hợp melamine và acid cyanuric trên các loài động vật khác nhau; ● Xác định sự xuất hiện những biomarker khi có biểu hiện những thương tổn ở thận với melamine / acid cyanuric. ● Nên có những nghiên cứu ảnh hưởng lâu dài của melamine/acid cyanuric đến cơ thể như thế nào? ► Điều chỉnh cho thích hợp hơn những phương pháp hiện hành để sử dụng cho xét nghiệm những mẫu máu và nước tiểu khi nhiễm độc melamine. ► Xác định liều xác đáng trong nghiên cứu động học độc tố của melamine ► Xác định biên độ của liều cho những nghiên cứu NOAEL* (3♂, 3♀; 400, 100, 25, 5, và 0 mg/kg; 28 ngày) ► Những công việc cần làm: Phase 1- Phát triển phương pháp phân tích (LC-MS) và tìm phép đo thích hợp trên chuột khi nhiễm độc melamine: * NOAEL (No observable adverse effect level) ► Cung cấp riêng lẻ từng chất một; ► Cung cấp đồng thời cùng lúc melamine và acid cyanuric; ► Cung cấp đồng thời cùng lúc cho những hợp chất tiền cấu tạo (pre-formed) của melamine cyanurate; ► Cung cấp theo thời gian so le của 2 chất melamine và acid cyanuric. Xác định NOAEL* khi xử lý kết hợp đưa melamine và acid cyanuric trên chuột trong 28 và 90 ngày để kiểm tra thời điểm trước khi hư thận và sự đáp ứng nhiểm độc tạo sỏi trong thận như thế nào. (12 ♂, 12 ♀; 4 mức liều + đối chứng) Phase 2- Nghiên cứu tác dụng hóa học trên chuột để tìm hiểu sự hấp thu, phân bố melamine và acid cyanuric khi cung cấp cho chuột thí nghiệm: Phase 3- Xác định NOAEL trên mô hình chuột thử nghiệm * NOAEL (No observable adverse effect level) Phase 4 - Tìm hiểu những Biomarker sinh ra do sự cố ở thận làm thay đổi trao đổi chất protein. Phát hiện sớm những biomarker do những rối loạn bởi melamine + cyanuric gây tổn thương thận, có thể đo lường qua nước tiểu. ► Homovanillic acid sulfate ► 4-Hydroxyproline ► α- GST (α-glutathione S-transferase)* ► μ-GST (μ-glutathione S-transferase)  * ► RPA-1 (Replication protein A1)* ► Clusterin (inhibits apoptosis)* ► Urine metabonomic profiling by 1H NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance) undergoing evaluation by the FDA Human nephrotoxicity biomarkers currently Phase 5- Xác định NOAEL* và nghiên cứu tác dụng hóa học Cho “heo mini” ăn để xác định NOAEL* khi kết hợp melamine và acid cyanuric trong mô hình thí nghiệm trên heo. Thí nghiệm này nhằm để suy ra trên người. Như vậy có thể kết luận cho đánh giá nguy cơ của melamine và acid cyanuric trên người. Phase 6- Những nghiên cứu tiếp theo Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, tiếp tục nghiên cứu cận lâm sàng, ngộ độc mãn tính và những biểu hiện của nó khi nhiễm melamine và acid cyanuric ở mức thấp. * NOAEL (No observable adverse effect level) Một số tài liệu tham khảo 1.The Melamine ELISA Test Kit is a competitive ELISA for the quantitative analysis of Melamine in contaminated samples.  2.Interim Safety and Risk Assessment of Melamine and its Analogues in Food for Humansa 3. Agra Quant® Melamine Test Kit: www.romerlabs.com 4. Melamine : 5.2007 pet food recall: 6. NTP Research Concept: Melamine/Cyanuric Acid: 7. Melamine-Contaminated Chinese Milk: Public health Perspective and Management in Thailand 8. Methods for Melamine Analysis via HPLC: www.mz-at.de/pdf/MelamineCrisis080926.pdf Thank you for Your attention