Một số vấn đề của sinh học phân tử

Một số vấn đề của sinh học phân tử Võ Thị Hương Lan NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2007. 181 tr. Từ khoá: ADN, GEN, genome, nhiễm sắc thể, ty thể, lục tạp, geomic, ADN, tái tổ hợp, ngân hàng các ADNc, cDNA, ADN genome , phản ứng PCR, kỹ thuật gen, phương pháp lai, Protein, tổng hợp protein, vận chuyển protein, tín hiệu tế bào, truyền tín hiệu tế bào, Thụ thể tyrosine kinase, Protein G, sinh trưởng, phát triển, hệ gen lưỡng bội, phôi, chu trình tế vào, phân chia tế bào. Tài liệu trong Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên có thể được sử dụng cho mục đích học tập và nghiên cứu cá nhân. Nghiêm cấm mọi hình thức sao chép, in ấn phục vụ các mục đích khác nếu không được sự chấp thuận của nhà xuất bản và tác giả. Mục lục LỜI NÓI ĐẦU........................................................................................................................ 5 U Chương 1 ADN VÀ GEN....................................................................................................................6 1.1 Khái niệm về gen........................................................................................................ 6 1.2 Genome (hệ gen) ...................................................................................................... 10 1.2.1. Genome của tế bào prokaryot (tế bào nhân sơ) ............................................................... 11 1.2.2. Genome của tế bào eukaryot (tế bào nhân thực) ............................................................. 13 1.3 Cấu trúc sợi nhiễm sắc trong tế bào eukaryot .......................................................... 14 1.3.1. Histone trong cấu trúc nucleosome.................................................................................. 15 1.3.2. Methyl hoá ADN ............................................................................................................. 17 1.4 Các gen trong genome eukaryot............................................................................... 18 1.4.1. Các gen trong cùng một họ gen ....................................................................................... 20 1.4.2. Gen lặp đi lặp lại liên tục................................................................................................. 21 1.4.3. Pseudogen (gen giả)......................................................................................................... 23 1.5 Thành phần ADN lặp lại trong genome eukaryot .................................................... 23 1.5.1. ADN vệ tinh (satelitte DNA) và ADN tiểu vệ tinh (minisatelitte DNA)......................... 23 1.5.2. Các đoạn ADN có khả năng di chuyển............................................................................ 24 1.6 Tương tác của T-ADN với genome thực vật............................................................ 29 1.7 ADN trong ty thể và lục lạp ..................................................................................... 32 1.7.1. ADN ty thể ...................................................................................................................... 32 1.7.2. ADN lục lạp..................................................................................................................... 33 1.8 Genomics.................................................................................................................. 33 1.8.1 So sánh genome............................................................................................................... 33 1.8.2 Genome người ................................................................................................................. 34 1.8.3 Nghiên cứu Genomics ở thực vật .................................................................................... 35 Chương 2 HOẠT ĐỘNG CỦA GEN TRONG TẾ BÀO ...............................................................38 2.1 Kiểm soát hoạt động của gen khi phiên mã ............................................................. 41 2.1.1 Kiểm soát khởi đầu phiên mã .......................................................................................... 42 2.1.2 Kiểm soát kết thúc phiên mã ........................................................................................... 50 2.1.3 Các protein điều khiển (regulatory proteins) ................................................................... 51 2.2 Kiểm soát sau phiên mã ........................................................................................... 53 2.2.1 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR của phân tử ARNm.................... 53 2.2.2 Độ dài của đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững của phân tử ARNm......................... 54 2.2.3 Độ bền vững của ARNm ................................................................................................. 54 2.2.4 ARN anti-sense................................................................................................................ 55 2.2.5 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing" ..................................................................... 56 2.3 Kiểm soát ở giai đoạn dịch mã và sau dịch mã ........................................................ 57 2.4 Biến đổi phân tử ARNm trong tế bào eukaryot ....................................................... 59 2.4.1 Phản ứng cắt intron và nối exon ...................................................................................... 60 2.4.2 Các intron có khả năng tự cắt ra khỏi phân tử ARNm-Phản ứng self-splicing ............... 62 2.4.3 Phản ứng trans-splicing nối hai exon của hai phân tử ARNm......................................... 64 2.4.4 Cấu trúc chung của phân tử ARNm................................................................................. 64 Chương 3 KỸ THUẬT ADN TÁI TỔ HỢP....................................................................................66 3.1 Phân cắt, phân ly ADN............................................................................................. 66 3.2 Đưa các đoạn ADN vào vector ................................................................................ 67 3.2.1 Các vector sử dụng trong kỹ thuật tách dòng .................................................................. 68 3.2.2 Đưa ADN vào vector ....................................................................................................... 70 3.3 Ngân hàng ADN....................................................................................................... 72 3.3.1 Ngân hàng các ADNc (cDNA library) ............................................................................ 72 3.3.2 Ngân hàng ADN genome (genomic DNA library).......................................................... 74 3.4 Sàng lọc một dòng từ ngân hàng ADN .................................................................... 76 3.4.1 Phương pháp sàng lọc chung ........................................................................................... 76 3.4.2 Phương pháp sàng lọc phân biệt "differential screening"................................................ 77 3.4.3 Phương pháp đi dọc nhiễm sắc thể “chromosome walking” ........................................... 78 3.4.4 Nhảy bước trên nhiễm sắc thể “jumping on chromosome”............................................. 80 3.5 Các phương pháp lai................................................................................................. 80 3.5.1 Phương pháp Southern blots............................................................................................ 81 3.5.2 Phương pháp northern blots............................................................................................. 82 3.5.3 Kỹ thuật lai in-situ ........................................................................................................... 82 3.5.4 Điều kiện phản ứng lai..................................................................................................... 82 3.6 RFLP trong nghiên cứu genome và lập bản đồ gen ................................................. 83 3.7 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................................... 86 3.7.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR....................................................................... 87 3.7.2 Một số dạng của phản ứng PCR ...................................................................................... 88 3.8 Kỹ thuật gen ............................................................................................................. 89 3.8.1 Nghiên cứu vai trò của ADN điều khiển, chức năng của gen hoặc protein..................... 89 3.8.2 Thay thế hoặc gây đột biến gen ....................................................................................... 92 3.8.3 Gây mất hoặc tăng cường chức năng của gen ................................................................. 93 3.8.4 Gen báo cáo “reporter gene” ........................................................................................... 96 3.8.5 Biến đổi genome thực vật ................................................................................................ 96 Chương 4 TỔNG HỢP VÀ VẬN CHUYỂN PROTEIN................................................................98 4.1 Vai trò của ARN vận chuyển (ARNt) trong tổng hợp protein ................................... 98 4.2 Tổng hợp protein ở bộ máy Ribosome.................................................................... 100 4.3 Vận chuyển protein ................................................................................................. 102 4.3.1 Vận chuyển vào mạng lưới nội chất .............................................................................. 103 4.3.2 Vận chuyển protein cấu trúc màng (membrane proteins).............................................. 105 4.4 Biến đổi sau dịch mã và kiểm tra chất lượng protein trong khoang ER................... 108 4.4.1 Tạo cầu liên kết disulfide (S-S) và cuộn gấp trong khoang ER..................................... 108 4.4.2 Hình thành cấu trúc multimer từ các chuỗi peptide....................................................... 109 4.4.3 Quá trình đường hoá protein.......................................................................................... 109 4.5 Vận chuyển từ mạng lưới nội chất đến Golgi và Lysosome.................................... 110 4.6 Vận chuyển từ Golgi đến bề mặt tế bào: Con đường tiết ngoại bào (exocytosis) .......... ................................................................................................................................ 110 Chương 5 TRUYỀN TÍN HIỆU TẾ BÀO.....................................................................................112 5.1 Thụ thể trên bề mặt tế bào...................................................................................... 114 5.2 Thụ thể nối với protein G....................................................................................... 117 5.2.1 Protein G........................................................................................................................ 117 5.2.2 Hoạt hoá hoặc ức chế cAMPase thông qua protein G ................................................... 119 5.3 Protein kinase phụ thuộc cAMP (cAPK hoặc kinase A)........................................ 121 5.4 Thụ thể tyrosine kinase và các protein Ras ............................................................ 124 5.4.1 Thụ thể tyrosine kinase (RTKs)..................................................................................... 124 5.4.2 Protein Ras và chuỗi các phản ứng truyền tín hiệu hoạt hoá bởi thụ thể tyrosine kinase ....................................................................................................................................... 127 5.5 Tín hiệu thứ cấp Ca+2 trong chuỗi truyền tín hiệu.................................................. 129 5.5.1 Inositol phospholipid ..................................................................................................... 130 5.5.2 Inositol triphosphate (IP3) và sự vận chuyển Ca+2 ra khỏi ER ................................... 130 5.5.3 Calmodulin- protein tạo phức với Ca+2 ở trong tế bào................................................. 132 5.6 Khuếch đại các tín hiệu bên ngoài tế bào............................................................... 133 5.7 Truyền tín hiệu qua các thụ thể nối với enzym trên bề mặt tế bào ........................ 135 5.7.1 Thụ thể guanylyl cyclase ............................................................................................... 135 5.7.2 Các oncogene và tín hiệu dẫn truyền từ thụ thể tyrosine kinase.................................... 136 5.7.3 Protein MAP kinase....................................................................................................... 136 5.8 Tyrosine kinase phối hợp với thụ thể. Thụ thể Tyrosine phosphatase................... 137 Chương 6 CHU TRÌNH VÀ PHÂN CHIA TẾ BÀO....................................................................139 6.1 Những đặc tính cơ bản của chu trình tế bào........................................................... 139 6.2 Chu trình tế bào ở giai đoạn phát triển phôi sớm................................................... 143 6.3 Protein cyclin.......................................................................................................... 145 6.4 Nấm men và hệ thống kiểm soát chu trình tế bào .................................................. 147 6.5 Kiểm soát phân bào ở động vật .............................................................................. 150 6.6 Vai trò của sợi vi ống tubulin trong phân bào........................................................ 152 Chương 7 SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN............................................................................154 7.1 Kiểm soát xác định giới tính .................................................................................. 155 7.2 Phát triển ở ruồi giấm Drosophila .......................................................................... 158 7.3 Hoạt động của các gen có nguồn gốc từ mẹ trong quá trình hình thành trục đầu-đuôi và trục lưng-bụng................................................................................................................ 159 7.3.1. Nhóm gen quyết định phát triển của phần đầu và ngực ấu thể (anterior-group genes) . 160 7.3.2. Nhóm gen qui định phát triển phần đuôi (posterior-group genes)................................. 162 7.3.3. Nhóm gen qui định phát triển trục lưng-bụng (dorsoventral-group genes) ................... 162 7.3.4. Nhóm gen qui định phát triển các cấu trúc tận cùng của ấu thể (terminal-group genes)164 7.4 Hoạt động của các gen trong hệ gen lưỡng bội (phôi) ........................................... 164 7.3.5. Các gen tạo đốt "gap" .................................................................................................... 166 7.3.6. Các gen cặp đốt "pair-rule"............................................................................................ 166 7.3.7. Các gen phân cực đốt..................................................................................................... 167 7.5 Các gen chọn lọc .................................................................................................... 167 5 Lời nói đầu Với mong muốn chia sẻ cùng bạn đọc mối quan tâm về Sinh học phân tử, một lĩnh vực đang được học tập và nghiên cứu ở Việt Nam, chúng tôi xuất bản cuốn sách "Một số vấn đề cơ bản của Sinh học phân tử" nhằm giới thiệu những quá trình quan trọng xảy ra trong tế bào (trình bày trong chương 1, 2, 4, 5, 6 và chương 7) và một số kỹ thuật cơ bản được sử dụng để nghiên cứu những quá trình đó (chương 3). Những quá trình này được nghiên cứu ở mức độ phân tử phần nào làm sáng tỏ sự giống và khác nhau trong cấu trúc của genome, cấu trúc của một gen giữa tế bào prokaryot và eukaryot (chương 1). Những cấu trúc đó liên quan đến các cách thức kiểm soát hoạt động của các gen ở giai đoạn phiên mã, sau phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein (chương 2). Quá trình tổng hợp protein, những biến đổi cấu trúc protein và những cách thức để nhận biết và vận chuyển protein đặc hiệu đến những vị trí đích khác nhau trong tế bào hoặc tiết ra bên ngoài được giới thiệu trong chương 4. Ngoài ra, chức năng và hoạt tính của những protein tham gia quá trình truyền tín hiệu được trình bày trong chương 5; của protein tham gia chu trình tế bào được trình bày trong chương 6 và những protein tham gia kiểm soát biệt hoá, phát triển, sinh trưởng và hình thành cơ thể được giới thiệu trong chương 7. Để có thể học được những kiến thức chuyên sâu trong lĩnh vực sinh học phân tử, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, các cô trong Khoa Sinh học Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay là Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội). Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn Phó Giáo sư Trương Nam Hải và Giáo sư Nguyễn Mộng Hùng đã có những nhận xét và góp ý quý báu cho cuốn sách. Lần đầu xuất bản, chắc chắn cuốn sách còn có những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự phê bình, góp ý của bạn đọc và đồng nghiệp. Với sự cảm ơn chân thành! Tác giả 6 Chương 1 ADN VÀ GEN 1.1 Khái niệm về gen Trải qua một thời gian dài, các khái niệm và định nghĩa về gen dần dần được hình thành dựa vào kết quả thí nghiệm, trước hết là các thí nghiệm di truyền cổ điển. Đầu tiên, từ phép lai giữa các cây đậu có những tính trạng khác nhau và theo dõi sự di truyền của chúng, Menden đã đưa ra kết luận mỗi tính trạng được quyết định bởi các allen của một gen. Một gen có thể có nhiều allen. Mức độ biểu hiện của tính trạng phụ thuộc vào sự kết hợp giữa hai allen. Đơn giản nhất là một gen có 2 allen (Aa). Khi đó tính trạng có thể biểu hiện ở 3 mức độ khác nhau: trội (AA), bán trội (Aa), hoặc lặn (aa). Tiếp theo đó, với một loạt các thí nghiệm tiến hành trên ruồi giấm Drosophila, Morgan và cộng sự đã nhận thấy một số tính trạng được quyết định không phải do các alen của một gen mà do nhiều gen. Điều quan trọng hơn nữa, dựa vào tần số trao đổi chéo giữa hai nhiễm sắc thể tương đồng trong quá trình phân bào giảm nhiễm (meiosis), Morgan có thể lập được bản đồ di truyền (genetic map) cho phép xác định vị trí của gen trên nhiễm sắc thể. Hai gen càng gần nhau thì tần số trao đổi chéo giữa chúng càng nhỏ. Trên thực tế, bản đồ di truyền cho biết vị trí của những gen liên quan đến các tính trạng hoặc các đột biến mà khoảng cách giữa chúng được tính bằng tần số trao đổi chéo (cM). Tuy nhiên, trao đổi chéo không xảy ra như nhau ở mọi vị trí trên sợi nhiễm sắc thể khiến cho khoảng cách giữa các vị trí trên bản đồ di truyền không phải lúc nào cũng tỷ lệ với tần số trao đổi chéo. Trước năm 1940, vị trí các gen trên nhiễm sắc thể được xem như các hạt cườm trong một chuỗi. Trao đổi chéo được xem là chỉ xảy ra giữa các gen mà không thể xảy ra trong một gen. Vì vậy, từ kết quả thí nghiệm, các nhà di truyền đã đưa ra 3 đặc tính để xác định một gen: 1. Gen qui định một tính trạng có thể quan sát được và chiếm một vị trí trên nhiễm sắc thể. 2. Gen được xem là đơn vị di truyền nhỏ nhất có thể bị đột biến. 3. Gen được xem là đơn vị di truyền nhỏ nhất mà trao đổi chéo không thể xảy ra trong một gen. Trao đổi chéo được thực hiện giữa các gen tương đồng. Từ những đặc tính này, rõ ràng hai tính trạng không giống nhau có thể phân biệt được thì phải do ít nhất hai gen khác nhau qui định. Rõ ràng, khái niệm về gen ban đầu này chỉ cho phép xác định mối tương quan theo kiểu một đột biến - một tính trạng - một gen. Trong thực tế, việc xác định tần số trao đổi chéo để tìm ra vị trí một gen gặp rất nhiều khó khăn do phải sàng lọc các cá thể đột biến từ số lượng cá thể rất lớn ở các thế hệ con cháu