Nhận dạng Vibrio spp thu được trên môi trường CPC agar từ mẫu nước biển tự nhiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG Báo cáo Vi sinh ứng dụng Chủ đề 4: Nhận dạng Vibrio spp thu được trên môi trường CPC agar từ mẫu nước biển tự nhiên 1.Mở đầu Như đã biết thì vi khuẩn (chẳng hạn như Vibrio spp) là một trong những nguyên nhân gây bệnh nguy hiểm cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản cũng như những tác hại của chúng với sức khỏe con người. Song những hiểu biết và những nghiên cứu về chúng đến thời điểm hiện tại cũng đang còn nhiều hạn chế. Do đó việc nghiên cứu, phân lập, nhận dạng chúng để có những hiểu biết sâu sắc từ đó làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng trị bệnh có vai trò to lớn trong nuôi trồng thủy sản cũng như trong việc bảo vệ sức khỏe con người! 2. Nội dung Trong quá trình nghiên cứu, phân lập để xác định các loài vi sinh vật các nhà khoa học đã sử dụng các môi trường khác nhau để tiến hành phân lập. Từ đó tiến hành nhận diện và tìm hiểu kĩ hơn về các Vi sinh vật bằng các phương pháp nghiên cứu khác. Môi trường CPC (cellobiose-polymixin B-colistin agar) được sử dụng để thử nghiệm phân lập xác định Vibrio vulnificus từ những mẫu nước trong môi trường tự nhiên. Ngoài ra từ môi trường này có thể tạo ra các môi trường phân lập khác bằng cách : +Pha trộn tỉ lệ môi trường của CPC khác nhau +Giảm nông độ Colistin trong môi trường nuôi cấy +Loại bỏ một thành phần nào đó của CPC agar Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS ước lượng mật độ của Vibrio vulnificus. CPC agar Phương pháp cấy vạch Những cuộc điều tra gần đây về V. vulnificus như của Arias và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu mẫu nước biển và mẫu động vật thủy sản tại khu vực ven bờ biển Tây Ban Nha thuộc biển Địa Trung Hải: Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS các khuẩn lạc CPC agar TCBS agar Đặc điểm hình thái Giả định đó là V. vulnificus Kiểm tra PCR (các đoạn mồi đặc biệt) Kết luận ? (nhanh, chính xác) Các khuẩn lạc của Vibrio vulnificus trên các môi trường TCBS và CPC V. vulnificus Trong quá trình nghiên cứu đó, V. vulnificus đã được phát hiện đầu tiên ở vùng biển Tây Ban Nha thuộc biển Địa Trung Hải. Nhưng chỉ có 7.6% khuẩn lạc phát triển và nhận dạng được thông qua những đặc điểm về hình thái của V. vulnificus (đã kiểm chứng bằng PCR). Những khuẩn lạc không thể kiểm chứng được bằng PCR thì sẽ không được nhận dạng. Người ta đã tiến hành việc xác định một số dòng tiêu biểu thu được trên môi trường CPC agar. Trong những nghiên cứu đó đã thấy sự xuất hiện của các loài tương tự như V. vulnificus nhưng chưa được kiểm chứng một cách chắc chắn Kết quả thu được nếu sai lệch thì do : +Sự thiếu chính xác của phương pháp PCR +sự có mặt của vi khuẩn cạnh tranh khác (chúng có đặc điểm hình thái tương tự như V. vulnificus). Bảng : đặc điểm sinh hóa một số loài Vibrio Để nhận diện những loài không phải Vibrio các nhà nghiên cứu đã chọn ra 284 chủng mà đã xác định không phải là V. vulnificus để phân lập trên CPC agar Trong 284 chủng được phân lập thì có 57 thể phân lập là những loài thuộc Vibrio không được nhận dạng. Những chủng này có kết quả dương tính với Arginine dehidrolase và chỉ một số chúng âm tính với Decacboxylase. Thêm vào đó khi tỉ lệ của Enterobacteriaceae thấp được xác định bởi API 20E. Và một vài dòng không thể phát triển được trên môi trường lên men thì không phải là Vibrio và không xác định. Những loài phong phú nhất như V. harveyi (chiếm 24%) thể phân lập cùng với V. splendidus, V. navarrensis, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus. Những loài còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn 1%. V. harveyi, V. splendidus là những loài phong phú nhất trong quá trình nghiên cứu suốt cả mùa nóng lẫn mùa lạnh và chúng có khả năng cạnh tranh với những loài khác có nhu cầu về độ mặn thấp như: V. vulnificus, V. parahaemolyticus. Điều này liên quan đến phạm vi tác động hẹp của V. vulnificus, V. parahaemolyticus Vì vậy, với điều kiện độ mặn cao ở Địa Trung Hải lại thuận lợi cho các loài Vibrio khác. Do đó nhận thấy rằng số lượng V. vulnificus gần như được giữ trong ngưỡng giới hạn nhất định Một vài Enterobacteriaceae cùng được xác định như: Serratia sp, Citrobacter sp và Proteus sp chiếm ưu thế lớn. Những thể phân lập phát triển này phát triển trên môi trường CPC agar lấy được từ mẫu nước với mật độ cao, không ổn định của trực khuẩn đường ruột Coliform. Có một chú ý rằng 2 loài V. alginolyticus, V. parahaemolyticus được xác định rằng không có khả năng sử dụng Cellulose như nguồn Cacbon tạo năng lượng duy nhất của chúng Sự phát triển quá mức của các loài Vibrio cạnh tranh khác bao gồm những dòng có khả năng sử dụng Cellulose sẽ làm giảm hoạt tính của môi trường CPC agar. Từ đó sẽ dẫn đến sự sai lệch của việc xác định những mẫu có trong môi trường nơi mà chúng sinh sống chiếm số it Bảng 1. Các loài (khác với V. vulnificus) thu được trên môi trường CPC agar từ mẫu nước biển tự nhiên Massad và Oliver cho rằng môi trường CPC agar là sự lựa chọn tốt nhất cho V. cholerae và V vulnificus. Đồng thời họ đã kiểm tra cùng với 19 loài Vibrio và một số loài khác và nhận ra rằng khi ủ ấm ở 400C chỉ có 1 trong 9 chủng V. parahaemolyticus là có thể phát triển được. Trong những nghiên cứu sau đó, một vài tác giả đã dùng môi trường CPC agar hoặc làm giảm hoạt tính môi trường bằng cách giảm nồng độ Colistin (mCPC) cho sự phân lập V. vulnificus từ những mẫu nước biển hay mẫu động vật thủy sản có vỏ từ những vùng biển khác nhau Moriss và cộng sự kiểm tra và nhận thấy rằng V. fluvialis, V. harveyi cũng có khả năng sử dụng Cellulose trên môi trường CPC. Mô hình nghiên cứu của Moriss và cộng sự CPC agar mCPC Kiểm tra PCR (các đoạn mồi đặc biệt) Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS Khuẩn lạc (có khả năng sử dụng Cellulose) Cytotoxin-hemolysin gene V. vulnificus (chiếm 28.7% các khuẩn lạc kiểm tra) Høi và cộng sự đã sử dụng môi trường CC agar (Cellobiose-Colistin agar) vì nhận thấy Polymyxin B không thật sự cần thiết (chất kháng sinh và Colistin được xem như chất kháng khuẩn). Họ nhận thấy rằng: môi trường mới này đã cải thiện một cách đáng kể tốc độ phân lập của V. vulnificus từ mẫu nước hoặc mẫu lắng cặn so với môi trường mCPC agar. Tuy vậy việc làm giảm nồng độ của chất kháng sinh không ngăn chặn được hoàn toàn khả năng cạnh tranh và ức chế của các loài Vibrio khác. Họ nhận thấy rằng những chủng V. vulnificus được phân lập từ những mẫu cá Chình bị bệnh không phát triển trên môi trường CPC agar. Điều này có liên quan đến việc đánh giá thấp sự có mặt của những loài này khi sử dụng môi trường CPC agar Ngoài ra họ đã kiểm tra 125 chủng đã xác nhận V. vulnificus và những chủng có liên quan phát triển trên môi trường chọn lọc. Tất cả thể phân lập của V. vulnificus phát triển trong môi trường MB (marine broth) ở 280C trong 14 giờ và nuôi cấy trên môi trường CPC agar trong 14 giờ ở 400C. Chỉ có một số phát triển được và cho dương tính với Cellulose. Việc kiểm tra được tiến hành trên 2 lô của môi trường CPC agar hoàn toàn độc lập. 91% mẫu cá Chình bị bệnh dòng E (serovar E) cùng với 25% thể phân lập của những mẫu trong môi trường và 33% thể phân lập của những dòng có liên quan (không phải dòng E) không thể phát triển. 125 dòng V. vulnificus và các chủng liên quan Môi trường MB 280C ;14h Tất cả đềuphát triển tốt CPC agar 400C; 14h CPC agar 400C; 14h Chỉ có71/125 dòng V. vulnificus phát triển được (chiếm 57%) Quan sát bảng số 2 Bảng 2. Sự phát triển của các dòng V. vulnificus trên CPC agar Sự kém phát triển của V. vulnificus từ những mẫu cá Chình bị bệnh có thể được giải thích là do nhiệt độ ủ quá cao (400C) vượt qua giới hạn nhiệt độ của những chủng này. Phát hiện này chỉ ra rằng khả năng phát triển trên môt trường CPC agar là không được chia sẻ ở tất cả chủng V. vulnificus đã được trình bày bởi Høi và cộng sự (đã tìm thấy rằng một vài chủng gây bệnh và chủng có liên quan phát triển ở trong MICs (là một chế phẩm vi sinh). 3. Kết luận Từ kết quả thu được ở trong những nghiên cứu hiện tại và trước đó ở vùng biển Địa Trung Hải có thể kết luận rằng: Môi trường CPC có tính đặc trưng thấp khi có những mẫu thí nghiệm chứa một số lượng lớn các loài Vibrio có khả năng sử dụng Cellulose như V. harveyi, V. splendidus. Việc này cũng có thể xảy ra với một số ít loài như V. navarrensis có khả năng sử dụng Cellulose. Một số chủng của các loài Vibrio mà không có khả năng sử dụng Cellulose như là nguồn Cacbon và nguồn năng lượng như V. alginolyticus, V. parahaemolyticus cũng có thể phát triển với những hình thái đặc trưng của V. vulnificus trên các đĩa thạch CPC agar ảnh hưởng đến độ chính xác và khả năng phán đoán của môi trường. Không phải tất cả những chủng V. vulnificus được kiểm tra thì đều phát triển được trên môi trường CPC agar. Phương pháp PCR có độ tin cậy cao khi nhận dạng. Tính chọn lọc thấp của môi trường CPC agar đối với thể phân lập do sự hiện diện với số lượng cao của các loài Vibrio cạnh tranh khác phù hợp hơn với môi trường đặc biệt này mà không thể ức chế chúng một cách hoàn toàn. Ngoài sự kết hợp của môi trường CPC agar và phương pháp PCR để phát hiện được sự có mặt của những loài gây bệnh này người ta còn sử dụng các phương pháp khác. Vấn đề đang còn tranh cãi hiện nay là để mang lại sự xác minh chính xác và có cơ sở cho các khuẩn lạc của V. vulnificus trên CPC agar khi mà trong những mẫu nghiên cứu có một số lượng lớn các loài cạnh tranh khác.