Những nét chung của kỹ thuật pcr

Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR: Nguyên tắc cơ bản của PCR: + Khái quát chung: PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ. Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật. Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94oC và như vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus ) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 755oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. + Các thông số kỹ thuật: Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng dưới đây. Bảng 1.8. Thành phần phản ứng PCR. Thành phần Số lượng ADN khuôn 10-100 ng dNTP (mỗi loại) 200 mM Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM Taq polymerase 1 U KCL 50 mM Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05% Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính. Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng. Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiện như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể ước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng. + Một số khó khăn với phản ứng PCR: PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự nhiễm ADN đều có thể đưa đến sản phẩm dương tính giả trong kết quả. Để hạn chế thực tế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết được sự nhiễm tạp từ các thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm. Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene với enzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị sao chép khoảng 9000 nucleotid và đột biến dịch khung xảy ra với số lượng tương ứng khoảng 40 000 nucleotid. + Một số kỹ thuật PCR khác: Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho định danh và định typ vi sinh vật là nested PCR (PCR lồng), revert transtriptase PCR (sao chép ngược) và asymmetric PCR (PCR một chiều). PCR lồng là phản ứng PCR bao bồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở vòng ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho phản ứng sau cho đoạn nằm trong gene. Như vậy phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để nhân phần gene nằm trong sản phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng PCR. Phản ứng PCR phiên mã ngược được dùng để nhân ADN từ ARN của virus. Việc kết hợp phản ứng này với PCR lồng có tác dụng phát hiện ARN tại thời điểm nhất định của mẫu. Kỹ thuật PCR một chiều được ứng dụng trong phương pháp giải trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR.phẩm PCR. + Sử dụng kỹ thuật PCR cho xác định typ vi sinh vật: Như đã trình bày ở trên, dùng cặp mồi đặc hiệu có thể xác định được gene đặc trưng cho loài hay thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Các chiến lược ứng dụng lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định typ vi sinh vật trong nghiên cứu dịch tễ học được chia làm 4 nhóm sau: - Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu. Trong trường hợp này dùng kết hợp kỹ thuật PCR và xử lý sản phẩm PCR với enzym cắt hạn chế và quan sát kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose hoặc polyacrylamid Một dẫn chứng cho kỹ thuật này là kết quả nhân gene synthase citrat trong Ricketsiae sau đó sản phẩm PCR được xử lý với enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các chủng với nhau (Regnery và Ctv, 1991). Các ví dụ sau (bảng 1.8) đã cho thấy hiệu quả của phương pháp này. Bảng 1.9. Một số ví dụ cho kỹ thuật RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) phân tích các gene đặc hiệu được nhân lên bằng kỹ thuật PCR. Chủng vi sinh vật nghiên cứu Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn Chlamydia spp. Kaltenboek et al (1992) Clostridium spp. Gurtler et al. (1991) Helicobacter pylori Foxall et al. (1992) Hepatilis C virus Okamoto et al.(1992) Mycobacterium tuberculosis Ross &Dwyer(1993) Nitrobacter spp. Navarro et al.(1992) Rickettsia spp. Regnery et al. (1991) Streptococcus spp. McClellADN et al. (1992) + Dùng kỹ thuật PCR cho ribotyping: Kỹ thuật PCR ribotyping là ứng dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các vùng gene của ARN (thuộc ribosom hay ARN vận chuyển). Tuy nhiên, trong thực tế kỹ thuật này yêu cầu kinh nghiệm, kỹ thuật và tốn thời gian để thực hiện phép lai. Để khắc phục hạn chế này một cách tiếp cận được trình bày ở đây là phân tích đa hình (dấu vân tay) của vùng gene này hay vùng gene xen kẽ của rARN hoặc tARN. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều chứa 2-22 phiên bản rARN trong mỗi tế bào (Gottlie và Rundner, 1985) trong khi đó vùng xen kẽ giữa 16S và 23S chứa một số các đoạn ADN lặp lại (Bacot và Reeves, 1991). Trong khi đoạn gene mã hoá cho tARN khá bảo thủ thì vùng xen kẽ của tARN lại thay đổi từ 2- 35bp đối với Bacillus subtilis (Vod, 1985) và từ 2-208bp trên đối tượng E.coli (Jinks-Roberson và Nomura, 1987). Như vậy khi sử dụng cặp mồi nhân toàn bộ vùng gene tARN có thể tạo ra được sự khác biệt giữa các chủng vi sinh vật. Kết quả ứng dụng kỹ thuật này trên một số đối tượng được trình bày trong bảng 1.9. Bảng 1.10.. Một số ví dụ sử dụng kỹ thuật PCR cho ribotyping. Vi sinh vật Tác giả và tài liệu dẫn Vi khuẩn lactic Klijin etal.(1991) Listeria Czajka et al.(1993) Mycoplasma Van Kuppeveld et al.(1992) Pseudomonas cepacia Kostman et al.(1992) Pseudomonas solanacearum Seal et al.(1992b) Staphylococcus spp. Welsh &McClellADN(1992) Streptococcus spp. McClellADN(1992) Khi số phiên bản rARN tăng có nghĩa là làm tăng độ nhạy của phương pháp ứng dụng. Engstrand và cộng tác viên (1920) đã công bố có thể sử dụng mẫu dò là đoạn nucleotid bổ sung với đoạn 16S của rARN như là một trong số mồi cho phép nhân phiên mã ngược ARN và phép phân tích được thực hiện nhờ kỹ thuật PCR nhân sản phẩm cDNA được dùng cho phát hiện Helicobacter spp. Độ nhạy của phương pháp phát hiện này tăng 50 lần so với phương pháp truyền thống. + Kỹ thuật rep-PCR: Một phương pháp trực tiếp cho kết quả finger printing không cần sử dụng enzym cắt hạn chế là rep-PCR dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn gene lặp lại. Thuật ngữ rep-PCR là chỉ phương pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Các chuỗi lặp lại có độ bảo thủ cao trong các đối tượng thuộc Enterobacteriaceae và một số đối tượng khác (Versalovic và Lupsky, 1991). Dùng các đoạn mẫu dò bảo thủ có thể lai với cả hai đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích thước 126bp (Enterobacterial repetitive intergeneic concensus-ERIC) và đoạn 38bp (repetitive extrageneic palindromic-REP) từ bộ gene của Enterobacteriaceae vi khuẩn gram âm và một số chủng có quan hệ xa khác. Có thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene bảo thủ để thu được kết quả finger printing sau khi nhân gene dùng bộ gene của các vi sinh vật có mang các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát hiện được trên agarose các đoạn gene có kích thước khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác nhau. Kỹ thuật này được ứng dụng đã đem lại kết quả tốt khi nghiên cứu mối quan hệ trên các đối tượng Bacillus subtilis (Versalovic và cộng sự, 1992), Citrobacter diversus (Woods và cộng sự, 1991), Rhizobium meliloti (Brujin, 1992). Thực tế phương pháp tạo ra kết quả finger printing đa dạng từ hầu hết các đại diện của Enterobacteriaceae (Versalovic và cộng sự, 1991) và được ứng dụng trên tất các vi khuẩn có mang các đoạn gene bảo thủ lặp lại trên. Phương pháp tương tự cũng cho phép phát hiện sự khác nhau từ các nguồn ADN trên các đối tượng nhân thực thuộc chi Naegleria như mô tả của Belkim và Quint (1992). Phương pháp này dùng cho phát hiện đa hình các đoạn gene chung cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn. + Kỹ thuật RAPD (Random amplified of polymorphic DNA): Hạn chế của các phương pháp nghiên cứu trước đây là phải dùng cặp mồi đặc hiệu. Theo cách này phải có các thông tin liên quan đến đoạn gene nhất định và đối tượng nghiên cứu. Khó khăn này được loại bỏ trong trường hợp dùng các mồi ngẫu nhiên hay tuỳ tiện, như vậy phương pháp phân tích không cần đến thông tin về geneome của đối tượng nghiên cứu…Cơ sở của phương pháp này đã được Welsh và McClell ADN (1990) mô tả khi dùng mồi ngẫu nhiên nhân gene và tạo ra phổ finger printing đặc trưng cho từng hệ gene (geneome). Mồi ngẫu nhiên có thể chỉ gồm 5 bp để nhân gene có thể tạo ra kết quả finger printing khá đa dạng. Có thể xem kết quả minh hoạ trong bảng và hình sau. Bảng 1.11. Ví dụ minh hoạ cho kỹ thuật RAPD. Đối tượng Tác giả và tài liệu dẫn Agaricus bisporus Khush&ctv(1992) Aspergillus fumigatus Aufauvre-Brown (1992) Bacillus thuringiensis Brousseau&ctv (1993) Brucella spp. Fekete&ctv(1992) Campylobacter spp. Mazurier&ctv(1992) CADNida spp. Lehmann 7 ctv (1992) Casuarina spp. Sellstedt& ctv(1992) Clostridium difficile McMillan& Muldrow(1992) Frankia spp Sellstedt& ctv(1992) Fusarium solani Crowhurst & ctv(1991) Helicobacter pylori Akopyanz & ctv(1992) Histoplasma capsulatum Woods& ctv (1993) Lactococcus lactic Cancilla & ctv (1992) Leptosphaeria maculans Goodwin&Annis(1991) Listeria monocytogenees Czajka & ctv (1993) Porphyromonas gingivalis Menard &ctv (1992) Rhizobium spp. Harrison &ctv (1992) Staphylococcos spp. Weish &McClellADN (1990) Streptococcus spp. Weish &McClellADN (1990) Streptococcus uberis Jayarao &ctv (1992) Hình 1.9. Minh hoạ kết quả phân tích sử dụng kỹ thuật RADP. b. Giải trình tự ADN Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. + Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả. + Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger: Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho phương pháp hóa học. Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. + Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger: Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). - Phương pháp truyền thống: Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn Bắt cặp ADN khuôn và mồi Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả. Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn. 2. Điều kiện bắt cặp mồi. 3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel. 5. Đọc kết quả. Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau: 1, Chuẩn bị ADN khuôn: Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện nay phương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lên phổ biến. 2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn: Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tự ADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi khuôn khác nhau. Hạn chế của loại mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene (300 – 500 bps) trong trường hợp phải đọc các gene có kích thước lớn cần phải tiến hành subclone để đọc tiếp. Điều này có thể thực hiện bằng cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại gắn vào vectơ để đọc cho hết trình tự của gene. Phương pháp tiếp theo là sử dụng mồi được thiết kế theo nguyên tắc bổ sung với trình tự của gene. Theo cách này, lần lượt các đoạn được đọc mà không cần thao tác subclone. Tuy nhiên theo cách đoạn mồi được thiết kế để đọc gene như vậy thì điều kiện cho từng phản ứng giải trình tự ADN với các mồi khác nhau sẽ không được tối ưu. Tuy vậy, hiện nay việc tổng hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ biến với giá thành thấp, hơn thế nữa với sự trợ giúp của tin học thì bước thiết kế mồi đã được tối ưu hoá. Vì vậy phương pháp này ngày càng trở lên thông dụng hơn. Sau khi mồi đã được thiết kế thì việc tiếp theo là chọn cách đánh dấu vào mồi hay vào đoạn ADN sẽ được tổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấu ngay tại đầu 5’ của mồi ở chỗ các băng ADN thường có cùng một cường độ tín hiệu. Thông thường với phương pháp đọc trình tự thủ công thì P32 thường được dùng. Ưu thế của nó là mang gốc photphat cao năng bêta mạnh, do đó chỉ cần trong thời gian ngắn là thu được tín hiệu. Hạn chế của phương pháp này là do mang năng lượng cao nên khó phân biệt giữa các băng khác nhau so với dùng S35. Hiện nay để giải quyết vấn đề này người ta dùng P33 tuy giá thành cao nhưng cho kết quả tốt hơn. 3, Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN: Enzym thông dụng thường dùng là sequenase (là một dạng của T7 DNA polymerase), enzym này có ưu thế hơn hẳn so với Klenow được dùng trước đây. Phản ứng được thực hiện nhanh hơn và thu được kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn++, ion này giúp cho quá trình sao chép có độ chính xác cao. Trước đây dNTPs đánh dấu với P32 được dùng để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên ngày nay nh