Nuôi cấy mô và tế bào

Nuôi cấy mô và tế bào Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực. Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy không chỉ thay đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho phép nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống trong một môi trường có kiểm soát. Một số khả năng ứng dụng của nhân nhanh đối với cây trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục trong chương trình chọn giống lai, nhân vật liệu sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc tế... Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên quan trực tiếp tới quá trình chọn giống. (1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng biến dị di truyền hiện có trong nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh, một ít kiểu gene chọn lọc về những tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền ngày một giảm trong nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số trường hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở lúa... Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất, nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các loài hoang dại để lai với cây trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc phục hàng rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, và phát triển thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene có ích đã được chuyển vào cây trồng. Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy bên ngoài noãn. Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào noãn bình thường sau khi thụ phấn. (2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội: Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu quả chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai trội, đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu gene. Ví dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine. (3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào: Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996). Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống.