Phần 4: Kiểm tra vi sinh

Phần 4: Kiểm tra vi sinh Định lượng Số tế bào hoặc CFU / g hay / ml mẫu Tổng số vi khuẩn hiếu khí Coliforms, E. coli Sta. aureus Str. faecalis Bac. cereus Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S Nấm men Nấm mốc Định tính Không có / 25 g hay / 25 ml mẫu E. coli (nhóm STEC, O157:H7) Salmonella Listeria Campylobacter Tăng sinh!!! Kiểm tra VSV trong thực phẩm Số lượng Định lượng > Định tính ? Định lượng Định tính ? Định lượng Định tính ? Định lượng < Định tính ? Que cấy Lấy mẫu Đủ lượng mẫu: ≥ 5 mẫu / lô hàng 25 g – 100 g / mẫu Đại diện, đồng đều Tên mẫu !!! Vô trùng Lưu mẫu Phân tích nhanh Lấy mẫu Tiêu chuẩn vi sinh Bảo quản mẫu Vận chuyển và bảo quản: 4OC Phân tích trong vòng 24 giờ sau khi mẫu được lấy Lưu mẫu: -70OC Phân tích mẫu Pha loãng mẫu: tỷ lệ 1/10 (nước muối sinh lý hoặc đệm phosphat vô trùng) Thao tác vô trùng!!! Thông tin mẫu!!!: Tên mẫu Độ pha loãng Đồng nhất mẫu!!! 3 độ pha loãng cuối Đánh giá kết quả Phương pháp MPN: Độ pha loãng cuối cùng phải có ít nhất 1 ống âm tính Phương pháp đếm trên thạch đĩa: Số khuẩn lạc / đĩa: 25 ≤ a ≤ 250 CFU (Colony Forming Unit) Pha loãng mẫu Đếm tế bào nấm men, bào tử nấm mốc Buồng đếm hồng cầu Đếm bằng buồng đếm hồng cầu A tế bào / ml hay g = a .4000 .1000 . H A: số tế bào / ml a: số tế bào / ô nhỏ 4.000 = hệ số chuyển thành 1 mm3 (thể tích 1 ô nhỏ = 1/4000 mm3 ) 1.000 = hệ số chuyển thành 1 ml (1 mm3 = 1/1000 ml ) H: hệ số pha loãng Tổng số tế bào trong số ô nhỏ đếm được: 340 tế bào a: số tế bào trung bình / ô nhỏ = ? Mẫu đếm được pha loãng ở 10-3 A = ? A tế bào / ml hay g = a .4000 .1000 . H 17.109 tế bào / ml hay g Đếm vi khuẩn hiếu khí Môi trường TSA: Trypticase Soye Agar PCA: Plat Count Agar Ghi tên mẫu Trên môi trường thạch đĩa Cấy trang trên bề mặt 0,1 ml dịch mẫu 1 ml dịch mẫu Cấy trộn lẫn trong thạch Máy đun cách thủy TO  45°C Đổ môi trường Surface- Etalement Trộn đều mẫu và môi trường Số lượng vi khuẩn Đơn vị tính: tế bào / ml hay g mẫu Phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu (nấm men, bào tử nấm mốc) Đơn vị tính: đơn vị khuẩn lạc - CFU (Colony Forming Unit) / ml hay g mẫu Phương pháp đếm trên thạch đĩa Phương pháp đếm qua giấy lọc Đếm qua giấy lọc (mẫu nước) ai: số khuẩn lạc / đĩa / độ pha loãng ni: số đĩa ở mỗi độ pha loãng V: thể tích mẫu cho vào đĩa cấy d: độ pha loãng mẫu đầu tiên (i) ai: 27 và 25, ai + 1: 97 và 119, ai + 2: 207 và 239 ni: 2 V: 0,1 ml Mẫu pha loãng: 10-2, 10-3, 10-4 A (CFU) /ml hay g = ? 3.216 x 102 CFU ĐẾM TỔNG SỐ NẤM MỐC Phương pháp: cấy trang trên môi trường thạch đĩa Môi trường: Czapek hoặc Sabouraud có bổ sung kháng sinh (penicillin + streptomycin hoặc chloramphenicol) Nhiệt độ ủ: 25OC – 30OC Tính kết quả: giống đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí Phương pháp MPN: Quy tắc Đếm vi khuẩn riêng biệt (Coliforms, E. coli, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus…) 3 độ pha loãng liên tiếp: 10-(n-2), 10-(n-1), 10-n 3 – 5 ống / độ pha loãng 1ml dịch mẫu / độ pha loãng / ống Có ít nhất một ống âm ở độ pha loãng cuối cùng!!! Kiểm tra chất lượng sữa: Cảm quan Màu sắc: màu tự nhiên của sữa tươi: Trắng đục – vàng kem nhạt Mùi: thơm đặc trưng của sữa, không có mùi lạ Vị: hơi ngọt, không có vị lạ Trạng thái: đồng nhất, không bị tách béo, không bị lợn cợn, không có tạp chất Hóa lý Hàm lượng chất khô: ≥ 10,5% Hàm lượng béo: ≥ 2,5% Độ acid: 0,13 – 0,16% Độ tươi của sữa: + Không bị tủa cồn 750 (SX sữa tươi tiệt trùng) + Không bị tủa cồn 680 (SX các sản phẩm khác) Vi sinh Thời gian làm mất màu xanh methylen: ≥ 90 phút Thử lên men lactic (pH = 4,0 – 5,0): đạt sau 3h Phương pháp lấy mẫu Lấy mẫu 100% lô hàng Mẫu sữa được lấy phải có đủ tính chất đại diện cho cả lô hàng đồng nhất Tỷ lệ lấy mẫu khoảng 0,5 – 1% tùy theo số lượng nhưng lượng mẫu lấy không ít hơn lượng cần thiết để thử. Sữa tươi lượng tối thiểu cần thiết để kiểm tra hóa học là 500 – 750ml. Phương pháp tiến hành Trường hợp 1: Sữa chứa trong các thùng nhựa 5 – 30kg hoặc chứa trong thùng nhôm 20 – 25kg giao nhận tại trạm. Dùng que khuấy trộn đều mẫu từng thùng Dùng pipet lấy mẫu cho vào đụng đáy thùng và lấy mẫu với số lần bằng nhau giữa các thùng sao cho tổng thế tích mẫu thử ≥ 400ml. Phương pháp tiến hành Mẫu thử cồn được lấy theo từng thùng. Các mẫu sữa còn lại sau khi thử cồn được trộn chung với nhau, lấy ra khoảng 800ml kiểm tra các chỉ tiêu còn lại. Mẫu được phân chia thành các mẫu thử trung bình để kiểm tra cảm quan, hóa lý, lên men lactic, xanh methylen, thử kháng sinh, lưu mẫu. Số lượng mẫu lấy thừa được nhập lại lô hàng Mẫu lưu được bảo quản ở nhiệt độ ≤ 60C/3 ngày Mẫu thử và mẫu lưu có ghi rõ mã số theo danh sách giao nhận sữa mỗi ngày Phương pháp tiến hành Trường hợp 2: Sữa giao nhận chứa trong xe bồn có từ 1 – 2 ngăn chứa sữa Dùng que khuấy loại lớn khuấy trộn sữa trong bồn Dùng muỗng hay pipet lấy mẫu riêng theo từng ngăn khoảng 400ml. Nếu bồn chỉ có một ngăn hoặc sữa của mỗi trạm chứa trong một ngăn thì lấy khoảng 800 ml. Mẫu thử cồn được lấy riêng theo từng ngăn. Trộn chung mẫu các ngăn (nếu cùng một trạm) hoặc để riêng (nếu không cùng một trạm), kiểm tra các chỉ tiêu còn lại. Mẫu được phân chia để kiểm tra, đánh số và lưu mẫu như trường hợp 1. Phương pháp thử xanh Methylen (Methylene blue) Methylen blue là chất chỉ thị oxy hóa – khử Dung dịch có màu xanh trong môi trường oxy hóa và không màu trong môi trường khử. Dung dịch methylen blue trong sữa ban đầu có màu xanh: môi trường oxy hóa. Vi sinh vật hiếu khí trong sữa phát triển: môi trường chuyển sang dạng khử và dung dịch dần dần mất đi màu xanh. Hàm lượng vi sinh vật có trong sữa có thể được xác định thông qua thời gian mất màu xanh của dung dịch. Phương pháp thực hiện Pha dung dịch xanh methylen 0,5% bằng nước cất. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng mặt trời và được sử dụng trong vòng 1 tuần. Cho vào ống nghiệm đã ghi rõ mã số 1ml dung dịch xanh methylen và 10ml mẫu sữa. Đậy nắp ống nghiệm, trộn đều bằng cách lật ngược ống nghiệm 1 – 2 lần. Để ống nghiệm vào tủ ấm 37 ± 10C Ghi giờ bắt đầu thử nghiệm Đánh giá kết quả Mỗi 30 phút quan sát sự đổi màu của mẫu thử 1 lần Đồng thời đảo mẫu trong ống nghiệm và kiểm tra nhiệt độ ủ, đảm bảo nhiệt độ luôn ở 37 ± 10C. Khi màu xanh của ống nghiệm chuyển sang màu trắng (có thể từ trên xuống hay từ phần dưới lên) còn lại khoảng 1cm chiều cao có màu xanh nhạt thì đọc giờ kết thúc. Kết quả: Thời gian mất màu xanh methylen = giờ kết thúc – giờ bắt đầu Phương pháp thử xanh Methylen (Methylene blue) Test kháng sinh (phương pháp thử Coban test) Trong ống thử có chứa sẵn môi trường thạch agar, bào tử Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, đường glucose, chất chỉ thị pH: Bromocresol purple. Sữa được cho trực tiếp vào ống thử và nhanh chóng hòa tan vào môi trường agar. Mẫu thử được giữ trong tủ 640C trong thời gian quy định. 64OC / 3h Kiểm tra kháng sinh trong sữa