Phân lập chủng nấm sợi có hoạt tính chitinase và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy

Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 76 PHÂN LẬP CHỦNG NẤM SỢI CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE VÀ TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Lê Đình Hưng (SV năm 4, Khoa Sinh học) GVHD: TS Trần Thanh Thủy, CN Trần Thị Minh Định 1. Mở đầu Hằng năm, một lượng lớn nông sản bị thất thoát vì các bệnh gây ra do vi nấm kí sinh. Việc phòng chống các nấm gây bệnh trên cây trồng là một vấn đề đang được các nhà khoa học quan tâm. Một giải pháp sinh học có hiệu quả cao và an toàn là sử dụng chitinase để phân giải chitin của thành tế bào nấm. Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase). Chitinase thuỷ phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4-glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp. Các cấu trúc mạch ngắn hơn của chitin và N-acetyl glucosamine không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong môi trường (MT) nuôi cấy nấm sợi (NS) sinh chitinase cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn carbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase. Chitinase còn có nhiều ứng dụng thực tế như thu nhận tế bào trần vì vách tế bào nấm có chứa chitin, sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine dùng làm dược phẩm với tính năng ưu việt như kháng các khối u, trị viêm khớp... Chitinase cũng được dùng trong ước tính sinh khối nấm, kiểm soát muỗi, sản xuất protein đơn bào. Vì chitinase là một enzyme ngoại bào có tầm quan trọng cao cần nghiên cứu rộng rãi, nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập chủng nấm sợi có hoạt tính chitinase và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy”. Mục đích đề tài là tìm ra các chủng nấm có hoạt tính chitinase mạnh và tối ưu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase của chủng nấm sợi phân lập được. Đề tài được thực hiện từ tháng 9 năm 2010 đến tháng 4 năm 2011 tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM). 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Mẫu phế thải hải sản được thu tại Công ty cổ phần xuất nhập khẩu Thủy sản Hợp Tấn, lô 19, đường số 8, khu công nghiệp Tân Tạo, quận Bình Tân, TP HCM và tại huyện Phước Tĩnh, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Năm học 2010 – 2011 77 Các loại môi trường: - MT 1: 10g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,5g cao nấm men; 1g glucose; 0,3g KH2PO4; 0,7g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 0,001g ZnSO4; 1000ml nước cất [8]. - MT 2: 10g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,3g urea; 0,2g KH2PO4; 0,3g CaCl2; 0,2g Tween 80; 1,4g (NH4)2SO4; 0,3g MgSO4.7H2O; 1000ml nước cất [7]. - MT 3: 5g chitin huyền phù; 0,2g MgSO4.7H2O; 0,9g K2HPO4; 0,2g KCl; 1g NH4NO3; 0,002g FeSO4.7H2O; 0,002g MnSO4; 0,002g ZnSO4; pha trong 1000ml đệm phosphate 50mM [9]. - MT 4: 10g chitin huyền phù; 3,5g NaNO3; 1,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KCl; 0,01g FeSO4.7H2O; 1000ml nước cất [5]. - MT 5: Malt Extract Agar (MEA) [6]. 2.2. Phương pháp - Phân lập một số chủng NS có hoạt tính chitinase. (F. Uyenco, 1988), - Khảo sát hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp đục lỗ. (Stephen, 2000), - Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại nấm sợi [2], - Tối ưu hóa bằng qui hoạch thực nghiệm [3], - Bước đầu thu nhận enzyme thô bằng dung môi [4]. 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Phân lập, tuyển chọn một số chủng NS có hoạt tính chitinase Bảng 1. Kết quả phân lập, tuyển chọn một số chủng NS có hoạt tính chitinase Stt Ký hiệu chủng Hoạt tính enzyme, D- d (cm) 1 B1 3,275 2 B2 1,200 3 B3 2,000 4 B4 2,200 5 B5 2,150 6 B6 3,000 7 B7 2,225 Từ mẫu (mai ghẹ) thu ở TP HCM và tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, chúng tôi phân lập được 7 chủng NS có hoạt tính chitinase (tạm gọi mỗi kiểu khuẩn lạc (KL) là một chủng). Chúng tôi chọn chủng nấm B1 để tiếp tục nghiên cứu vì chủng nấm này có hoạt tính chitinase cao nhất. 3.2. Định danh đến chi chủng nấm sợi B1 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 78 Nuôi cấy chủng nấm sợi B1 trên đĩa petri có MT 5, quan sát các đặc điểm đại thể của chủng B1. Tiến hành làm phòng ẩm, cấy chủng B1 vào phòng ẩm, quan sát hình thái vi thể của chủng B1 dưới kính hiển vi. So sánh các đặc điểm quan sát được với khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng [3] và A. Samson [10]. Kết quả được ghi nhận ở bảng 2. Bảng 2. Kết quả định danh chủng B1 đến chi Đặc điểm của chủng nấm sợi B1 Đặc điểm phân loại chi Aspergillus theo [3] và [10] - KL phát triển nhanh.KLban đầu có màu trắng, sau chuyển thành màu xanh lục đậm dần theo thời gian. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu. - Bào tử đính. Giá bào tử không phân nhánh, có phần đỉnh phình to ra tạo thành bọng. - Khối bào tử trần đính bên ngoài thể bọng. - KLthường phát triển nhanh, có màu trắng, vàng, vàng nâu, nâu đen hoặc hơi có màu lục. - Hệ sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong sẫm màu. - Giá bào tử trần không có nhánh, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy, hình elipse hoặc hình nửa cầu. - Khối bào tử trần đính bọng có thể có các dạng hình cột, hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn. Từ kết quả định danh chúng tôi kết luận chủng nấm B1thuộc chiAspergillus. Hình 1. Hình thái đại thể chủng B1 Hình 2. Hình thái vi thể chủng B1 3.3. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1 Nuôi chủng Aspergillus sp.B1 trong các bình tam giác 250 ml chứa 50 ml các MT1, MT2, MT3, MT4. Sau 3 ngày nuôi cấy lắc, tiến hành xác định hoạt tính chitinase bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được thể hiện qua biểu đồ 1. Năm học 2010 – 2011 79 3.55 3.05 2.85 2.4 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 MT 1 MT 2 MT 3 MT 4 Môi trường D - d (c m ) Biểu đồ 1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1 Qua biểu đồ, ta thấy được trong MT 4 thì hoạt tính chitinase chỉ ở mức khá, còn trong MT 2 và 3 thì hoạt tính chitinase ở mức mạnh, MT 1 hoạt tính chitinase rất mạnh. Điều này cho thấy Aspergillus sp.B1 có tính thích nghi cao. MT 1 cho hoạt tính mạnh nhất vì nó có hàm lượng khoáng cao hơn MT 2 và MT 4, có hàm lượng chitin huyền phù cao hơn MT 3. Hình 3. Hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1 ở các MT khác nhau (từ trái sang: MT1, MT2, MT3, MT4) 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1 Nuôi chủng Aspergillus sp.B1 trong các bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT1. Thử hoạt tính chitinase bằng phương pháp đục lỗ sau 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, kết quả được thể hiện qua đồ thị 1. 1.267 1.233 1.800 2.233 3.267 3.000 2.950 - 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h Thời gian D - d (c m ) Đồ thị 1. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp.B1 Kết quả cho thấy, hoạt tính chitinase của Aspergillus sp.B1 cao nhất vào lúc 72h. Giai đoạn đầu hoạt tính chitinase chưa ổn định do các tế bào nấm phải thích nghi với MT, sau khi thích nghi thì quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ, chitinase được tổng hợp nhiều để phân giải chitin, cung cấp nguồn carbon cho các tế bào. Kết quả này thống nhất với nghiên cứu của Lê Thị Huệ [5]. Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 80 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù trong MT nuôi cấy đến hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp.B1 Nuôi chủng Aspergillus sp.B1 trong các bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT 1, lần lượt thay đổi nồng độ chitin huyền phù ở các giá trị 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3,0%. Sau 72h, thử hoạt tính chitinase bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được thể hiện qua đồ thị 2. 3.6 3.65 3.7 3.65 3.45 3.4 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Nồng độ chitin huyền phù (%) D - d (c m ) Đồ thị 2. Sự biến thiên hoạt tính chitinase theo nồng độ chitin huyền phù Nồng độ chitin huyền phù thích hợp nhất cho sự phát triển của Aspergillus sp.B1 trong khoảng từ 1% đến 2%, đạt cực đại ở nồng độ 1,5%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Felse và Panda, 2000. Khi nồng độ chitin huyền phù lớn hơn 2%, hoạt tính chitinase giảm rõ rệt, điều này có thể do lượng chitin huyền phù cao đã giảm sự tiếp xúc giữa nấm với không khí, làm giảm lượng oxygen cần thiết cho các hoạt động sống của một loài hô hấp hiếu khí như Aspergillus sp.B1. 3.6. Ảnh hưởng của pHlên hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp.B1 Nuôi chủng Aspergillus sp. B1trong các bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT 1, ở nồng độ chitin huyền phù 1,5%, thay đổi pH của MT ở các giá trị 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0. Sau 72h, thử hoạt tính chitinase bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được thể hiện qua đồ thị 3. 1.65 3.55 3.78 3.9 3.65 3.65 3.6 3.53.75 1.4 2.95 0 1 2 3 4 5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 pH D - d (c m ) Đồ thị 3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1 pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp chitinase của Aspergillus sp.B1 là 6, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Takashi và cộng sự, 2002. Năm học 2010 – 2011 81 Hình 4. Hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1ở pH= 3 Hình 5. Hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp. B1ở pH= 6 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên hoạt tính chitinase của chủng Aspergillus sp.B1 Nuôi cấy chủng Aspergillus sp.B1 trong MT 1 ở nồng độ chitin huyền phù 1,5%, pH= 6, thay đổi nguồn nitrogen của MT lần lượt là urea, cao nấm men, NH4Cl, peptone, cao thịt, KNO3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NaNO2, NaNO3, NH4NO3. Sau thời gian tối ưu, thử hoạt tính chitinase bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được thể hiện qua biểu đồ 2. 3.725 3.775 1.650 3.775 3.775 3.350 0.950 2.550 3.600 3.300 1.100 - 1.0 2.0 3.0 4.0 Urea Cao nấm men Ammonium chloride Peptone Cao thịt Potassium nitrate Ammonium sulfate Ammonium hydrogen phosphate Sodium nitrite Sodium nitrate Ammonium nitrate D - d (cm) Biểu đồ 2. Sự biến thiên hoạt tính chitinase theo từng nguồn nitrogen khác nhau Qua biểu đồ 2, ta thấy rằng chủng Aspergillus sp.B1 sinh tổng hợp chitinase tốt với nguồn nitrogen hữu cơ như urea, cao nấm men, peptone, cao thịt hơn là với nguồn nitrogen vô cơ. 3.8. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng qui hoạch toán học Phương pháp tối ưu hóa bằng qui hoạch toán học là một phương pháp ưu việt với khả năng khảo sát nhiểu yếu tố và tính chính xác cao. Chúng tôi chọn 3 yếu tố để tối ưu hóa bằng qui hoạch thực nghiệm là thời gian, nồng độ chitin huyền phù và pH môi trường. Tiến hành 27 thí nghiệm theo ma trận thực nghiệm. N gu ồn n itr og en Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 82 Chọn mức (-), (0), (+) theo các thí nghiệm khảo sát rời rạc với mức (0) là giá trị tối ưu, mức (-) là cận dưới tối ưu, mức (+) là cận trên tối ưu. Xây dựng hàm mục tiêu theo các công thức sau Khảo sát kết quả ma trận thực nghiệm và chọn ymax và ymin. Chọn 0,63 là giá trị tùy chọn cho dmax, 0,2 là giá trị tùy chọn cho dmin trên thang mong đợi. Ta có hệ phương trình. Giải hệ phương trình ta được bo và b1. Từ đó ta tính được y’ theo công thức: Thế y’ vào hàm mục tiêu, ta tính được xác suất đặc trưng cho hoạt tính chitinase của chủng nấm sợi (D). Xác định điều kiện thí nghiệm của Dmax, kết luận điều kiện thí nghiệm của quá trình tối ưu thực nghiệm. Bảng 3. Kết quả khảo sát biến thiên hoạt tính chitinase bằng qui hoạch thực nghiệm STT Nồng độ chitin huyền phù (%) pH Thời gian (h) Kết quả ∆d (y) y’ D 1 1 (-) 5,5 (-) 66 (-) 3,2 -0,0848 0,3367 2 1 (-) 6,0 (0) 66 (-) 3,25 -0,4475 0,20921 3 1 (-) 6,5 (+) 66 (-) 2,95 -0,28505 0,26452 4 1,5 (0) 5,5 (-) 66 (-) 3,05 -0,20495 0,29303 5 1,5 (0) 6,0 (0) 66 (-) 3,05 -0,20495 0,29303 6 1,5 (0) 6,5 (+) 66 (-) 3,1 -0,1649 0,3075 7 2 (+) 5,5 (-) 66 (-) 3,05 -0,20495 0,29303 8 2 (+) 6,0 (0) 66 (-) 2,95 -0,28505 0,26452 9 2 (+) 6,5 (+) 66 (-) 2,95 -0,28505 0,26452 10 1 (-) 5,5 (-) 72 (0) 2,867 -0,351533 0,24141 11 1 (-) 6,0 (0) 72 (0) 2,9 -0,3251 0,25053 12 1 (-) 6,5 (+) 72 (0) 3,183 -0,098417 0,33173 13 1,5 (0) 5,5 (-) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 14 1,5 (0) 6,0 (0) 72 (0) 3,067 -0,191333 0,29794 15 1,5 (0) 6,5 (+) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 16 2 (+) 5,5 (-) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 Năm học 2010 – 2011 83 17 2 (+) 6,0 (0) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 18 2 (+) 6,5 (+) 72 (0) 2,95 -0,258617 0,26452 19 1 (-) 5,5 (-) 78 (+) 3,05 -0,20495 0,29303 20 1 (-) 6,0 (0) 78 (+) 2,983 -0,258617 0,27386 21 1 (-) 6,5 (+) 78 (+) 3,033 -0,218567 0,288145 22 1,5 (0) 5,5 (-) 78 (+) 2,867 -0,351533 0,24141 23 1,5 (0) 6,0 (0) 78 (+) 3,116 -0,152084 0,31215 24 1,5 (0) 6,5 (+) 78 (+) 3,126 -0,144074 0,31507 25 2 (+) 5,5 (-) 78 (+) 3,067 -0,191333 0,29794 26 2 (+) 6,0 (0) 78 (+) 3,033 -0,218567 0,288145 27 2 (+) 6,5 (+) 78 (+) 3,25 -0,4475 0,20921 Theo kết quả trên, nghiệm thức 1 (nồng độ chitin 1%, pH 5,5, thời gian nuôi cấy là 66h) là tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi Aspergillus sp. B1. Kết quả khảo sát các yếu tố trên giữa tối ưu rời rạc và tối ưu theo qui hoạch có sự sai khác nhỏ, nhưng vì phương pháp tối ưu toán học là phương pháp cho kết quả đáng tin cậy nên chúng tôi chọn các điều kiện nồng độ chitin, thời gian nuôi cấy và pH theo tối ưu qui hoạch toán học. Kết hợp với kết quả tối ưu rời rạc các yếu tố khác, điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng Aspergillus sp. B1 như sau: 10g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,5g cao nấm men; 1g glucose; 0,3g KH2PO4; 0,7g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 0,001g ZnSO4; 1000ml nước cất; pH= 5,5. Thời gian nuôi cấy 66h. 3.9. Kết quả khảo sát dung môi tối ưu để thu chế phẩm enzyme Nuôi chủng Aspergillus sp.B1 trong MT tối ưu đã khảo sát, thu dịch chiết enzyme, tủa 50ml dịch chiết enzyme bằng cồn, acetone, (NH4)2SO4. Cân khối lượng chế phẩm enzyme thu được, từ đó xác định loại và tỷ lệ dung môi tối ưu. Kết quả được trình bày trong bảng 4. Bảng 4. Kết quả khảo sát dung môi dùng để tủa dịch chiết enzyme Dung môi Cồn Acetone (NH4)2SO4 Tỉ lệ 1:2 1:3 1:4 1:2 1:3 1:4 70% bão hòa 80% bão hòa Khối lượng enzyme 0,06g 0,02g 0,02g 0,02g 0,02g 0,02g 0,66g 0,72g Chúng tôi nhận thấy tủa bằng (NH4)2SO4 tuy thu được khối lượng enzyme thô nhiều nhất nhưng trong enzyme thô lẫn rất nhiều tinh thể muối (NH4)2SO4. Tủa bằng acetone thu được khối lượng enzyme thô thấp. Từ đó chúng tôi chọn tác nhân tủa là cồn với tỉ lệ là 1:2. 4. Kết luận và kiến nghị 4.1. Kết luận - Đã phân lập 1 chủng có hoạt tính chitinase mạnh, D - d= 3,275cm. Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 84 - Kết quả định danh chủng trên thuộc chi Aspergillus. - Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu như sau: 10 g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,5g cao nấm men; 1g glucose; 0,3g KH2PO4; 0,7g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 0,001g ZnSO4; 1000ml nước cất; pH= 5,5. Thời gian là 66h. - Đã xác định dung môi để tủa chế phẩm enzyme là cồn với tỉ lệ 1 dịch chiết enzyme: 2 cồn. 4.2. Kiến nghị Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chitinase từ chủng NS nghiên cứu để tìm hướng ứng dụng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. 2. Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lí phòng chống nấm mốc và mycotoxin, Nxb Khoa học và Kỹ thuật. 3. Hoàng Đình Hòa (1980), “Bàn về chất lượng sản phẩm thực phẩm và phương pháp tối ưu hóa”, Báo Lương thực thực phẩm, 112. 4. Đinh Minh Hiệp, Phạm Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008), “Thu nhận chitinase từ chủng Trichoderma TĐ14 và khảo sát khả năng kháng vi nấm Candida albicans”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr. 48 - 51. 5. Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Sư phạm TP HCM. 6. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục. 7. A. M. Murad and others, “Proteomic analysis of Metarhizium anisopliae secretion in the presence of the insect pest Callosobruchus maculatus”, Microbiology (2008), 154, pp. 3766 - 3774. 8. Guoqing Xia, Chunsheng Jin, Ju Zhou, Shoujun Yang, Shuzheng Zhang, Cheng Jin (2001), “A novel chitinase having a unique mode of action from Aspergillus fumigatus YJ- 407”, Eur. J. Biochem. 268, pp. 4079 - 4085. 9. M. H. El- Katatny, W. Somitsch, K- H. Robra, M. S. El- Katatny, G. M. Gubitz (2000), “Production of Chitinase and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for Control of the Phytopathogenic Fungus Sclerotium rolfsii”, Food technol. Biotechnol. 38 (3), pp. 173 - 180. 10. Robert A. Samson (1996), Introduction to food-borne fungi, Centraalbureau Voor Schimmelcultures, pp. 52 - 54.