Quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

QUY TRÌNHPHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊUVI SINH VẬT CHƯƠNG VI TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (Aerobic Plate Count) Tổng số vi sinh vật hiếu khí 1. Định nghĩa Là những VSV tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện hiếu khí Chỉ thị mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm 2. Nguyên tắc Theo phương pháp đổ đĩa Ủ ở nhiệt độ 370C/48h hoặc 300C/72h 4. Thiết bị - Tủ ấm 300C Tổng số vi sinh vật hiếu khí 3. Môi trường nuôi cấy - Saline Pepton Water (SPW) - Plate Count Agar (PCA) Chuẩn bị mẫu - Cắt mẫu: lượng mẫu cắt là 10g hoặc 25g - Đồng nhất mẫu bằng stomacher trong 30s - Pha loãng mẫu Đổ đĩa Nuôi ủ Ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ Kết quả N A (cfu/g) = --------------------------- n1Vf1 + …… + niVfi - Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa Tính kết quả theo công thức: Ví dụ: Khi phân tích 1g mẫu trong trường hợp cụ thể thu được kết quả như sau: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 Kết quả Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 21 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ Định nghĩa Coliforms Coliform tổng số Coliform chịu nhiệt Feacal Coliform E.Coli Nguyên tắc Định lượng Coliform trên môi trường đặc trưng Khẳng định Môi trường sử dụng - TSA - VRB - BGBL Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu Phân tích Đếm kết quả Khẳng định Phân tích Sử dụng phương pháp đỗ đĩa Thể tích mẫu sử dụng: 1 ml Đổ môi trường TSA, chờ 1 – 2 giờ Đổ môi trường VRB Ủ 370C, 24h Đọc kết quả Khuẩn lạc đặc trưng cho Coliform: khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính >0,5 mm, có vòng tủa muối mật Khẳng định Sử dụng môi trường BGBL Dương tính ? Âm tính ? Tính toán kết quả Coliform tổng số = (cfu/ml) N n1vf1 +…+nivfi x R ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Nguyên tắc Mẫu được pha thành một dãy thập phân liên tiếp và mẫu được đưa vào môi trường thích hợp Ủ và đọc số ống dương tính Tra bảng Mac – crady  tính toán số lượng MẪU PHA LOÃNG LSB BGBL EC broth EMB IMViC Coliforms 370C/24h Coliform chịu nhiệt 440C/24h Trypton 440C/24h Kovac’s Feacal Coliform E.Coli Định lượng Coliforms PHA LOÃNG 370C/24h + + + + + + - - - 10-1 10-2 10-3 2 1 1 Tra bảng 370C/24h Định lượng Coliform chịu nhiệt PHA LOÃNG 370C/24h + + + + + + - - - 10-1 10-2 10-3 Tra bảng Định lượng Feacal Coliform PHA LOÃNG 370C/24h + + + + + + - - - 10-1 10-2 10-3 Định lượng E.Coli PHA LOÃNG 370C/24h + + + + + + - - - 10-1 10-2 10-3 ĐỊNH TÍNH E.COLI Định nghĩa Sinh indol Sinh acid Không sử dụng citrate Nghiệm pháp IMViC phù hợp Sử dụng lactose và sinh hơi 2. Nguyên tắc Định tính và xác định có hay không có E.Coli trong mẫu Mẫu  BGBL  EMB  IMViC 3. Môi trường Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methyl red Thuốc thử α-naphtol KOH 40 % - Saline Pepton Water (SPW) - BGBL broth EMB agar TSA - MR – VP broth - Trypton broth - Simmon Citrate Agar Tăng sinh - Môi trường sử dụng: canh BGBL - Ủ ở nhiệt độ 440C trong 24h - Chọn những ống sinh hơi  cấy phân lập Phân lập - Môi trường sử dụng: EMB agar - Cấy chuyển từ BGBL  EMB, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h - Chọn những khuẩn lạc đặc trưng và cấy chuyển sang môi trường TSA Khẳng định - Thử nghiệm IMViC: + + - - Kết luận Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 25g mẫu PHÁT HIỆNSALMONELLA 1. Định nghĩa Trực khuẩn gram (-), hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi. Có khả năng di động Lên men được glucose và mannitol Không lên men được saccharose và lactose Không phân giải urea và không sinh indole 2. Nguyên tắc Đây là phương pháp định tính để xác định có hay không có Salmonella trong mẫu Mẫu  tiền tăng sinh  tăng sinh chọn lọc  phân lập  khẳng định 3. Môi trường - BPW - RV broth 3.1. Môi trường tiền tăng sinh 3.2. Môi trường tăng sinh - MGMC broth - SC broth - XLD agar - BPLS agar - BSA - HE agar 3.3. Môi trường phân lập 3.4. Môi trường khẳng định - TSA - TSI agar - Urea broth - LDC broth - ODC broth - Mannitol Phenol red broth Tiền tăng sinh - Môi trường sử dụng: BPW Tăng sinh chọn lọc - Môi trường sử dụng: RV broth - Cấy chuyển từ môi trường BPW sang môi trường RV - Ủ ở 420C trong 24h Phân lập - Môi trường sử dụng: XLD, BPLS, HE, BSA - Cấy chuyển từ RV sang môi trường XLD, BPLS, HE, BSA - Ủ ở 370C trong 24 h Kết quả phân lập - Môi trường XLD - Môi trường BPLS - Môi trường HE - Môi trường BSA - Cấy chuyển sang môi trường TSA Khẳng định Thử nghiệm trên môi trường TSI Sử dụng glucose Không sử dụng lactose Sinh H2S Sinh gas Khẳng định Thử nghiệm LDC (+) Thử nghiệm Urea (-) Thử nghiệm Mannitol (+) Thử nghiệm Indol (-) Thử nghiệm VP (-) Thử nghiệm kháng huyết thanh Thử nghiệm này được thực hiện với kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H. Thực hiện phải có chứng âm là nước muối sinh lý Phản ứng (+): ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối Kết luận Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25 g mẫu ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS Nguyên tắc Dựa vào phương pháp cấy trang Khẳng định các khuẩn lạc đặc trưng bằng thử nghiệm coagulase Môi trường 1. Blood agar 2. Baird Parker agar 3. Huyết tương thỏ Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu Tương tự như chuẩn bị mẫu cho phân tích E. Coli Phân lập Môi trường sử dụng: Baird Parker Agar có bổ sung egg yolk Sử dụng phương pháp cấy trang Ủ 370C trong 48 giờ Kết quả phân lập Trên môi trường BA Trên môi trường BP Khẳng định Sử dụng phản ứng coagulase - + Tính toán kết quả Trong đó: F: độ pha loãng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Ht = Số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng ĐHT dương tính Số khuẩn lạc đặc trưng Ha = Số khuẩn lạc không đặc trưng cho phản ứng dương tính Số khuẩn lạc đặc trưng Xác định Vibrio sp. Nguyên tắc Vibrio spp. là VSV ưa mặn bắt buộc, ngoại trừ V. cholerae Sử dụng môi trường thích hợp để phân lập Vibrio Sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Môi trường sử dụng APW (Canh pepton kiềm) TCBS TSI LDC Chuẩn bị mẫu Tăng sinh chọn lọc Phân lập Khẳng định Tăng sinh chọn lọc - Môi trường sử dụng: APW Phân lập - Môi trường sử dụng: TCBS Khuẩn lạc đặc trưng của V. cholerae Khuẩn lạc đặc trưng của V. parahaemolyticus Khẳng định Thử nghiệm kháng huyết thanh Mục đích: xác định các dòng Vibrio khác nhau Kết luận Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g mẫu Xác định Listeria monocytogenes Nguyên tắc Trải qua 2 lần tăng sinh Sử dụng các môi trường chuyên biệt để phân lập Khẳng định Môi trường sử dụng Giai đoạn tăng sinh (2 lần) UVM LB Giai đoạn phân lập Oxford Agar Palcam Giai đoạn khẳng định Thạch máu Thạch mềm BHI Rhamnose phenol red Xylose phenol red Thuốc thử catalase Thuốc thử oxydase Tăng sinh chọn lọc Sử dụng môi trường UVM hoặc LB Trải qua 2 lần tăng sinh chọn lọc Phân lập - Sử dụng môi trường Oxford hoặc Palcam - Khuẩn lạc đặc trưng trên Oxford Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Palcam Khẳng định - Thử nghiệm tan huyết - Thử nghiệm Catalase - Thử nghiệm Oxydase - Thử nghiệm tính di động bằng phương pháp giọt treo - Thử nghiệm tính di động trên BHI - Thử nghiệm khả năng biến dưỡng đường Rhamnose (+) Xylose (-) - Thử nghiệm CAMP Chủng kiểm tra S. aureus R. equi L. innocua L. monocytogenes Kết luận Phát hiện hay không phát hiện L. monocytogenes trong mẫu Định lượngTổng nấm men, nấm mốc Định nghĩa Đây là nhóm vi sinh vật có nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác Tất cả các loài nấm men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp từ bên ngoài Phân biệt nấm men, nấm mốc: Nấm men là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm mốc là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi. Thỉnh thoảng có thể nhìn thấy các tế bào kết nối thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cây trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn khuẩn ty. Môi trường Pepton broth 1% DG 18 DRBC Chuẩn bị mẫu Cân 10g mẫu Cho dung dịch pha loãng vào và ngâm trong 30 phút Đồng nhất mẫu và pha loãng thành những nồng độ thích hợp HẾT CHƯƠNG VII