Sản xuất kháng thể đơn dòng

Kháng thể là protein được hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện và trung hòa những tác nhân xâm nhiễm ngoại lai như vi khuẩn, virus, tế bào, Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó. • Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody - mab) là kháng thể được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất. • Kháng thể đa dòng là kháng thể bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác nhau.

pdf54 trang | Chia sẻ: nguyenlinh90 | Lượt xem: 1352 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Sản xuất kháng thể đơn dòng, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
• Kháng thể là protein được hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện và trung hòa những tác nhân xâm nhiễm ngoại lai như vi khuẩn, virus, tế bào,Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó. • Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody - mab) là kháng thể được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất. • Kháng thể đa dòng là kháng thể bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác nhau. Kháng thể đa dòng • Dễ sản xuất • Tương tác KN-KT không chuyên biệt • Giới hạn số lượng • Tiết kiệm thời gian Kháng thể đơn dòng • Đòi hỏi kĩ thuật cao • Tương tác KN-KT chuyên biệt • Không giới hạn số lượng • Tốn thời gian George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984 Chọn động vật gây nhiễm, chọn kháng nguyên (Ag) Gây đáp ứng miễn dịch Dung hợp, tạo tế bào lai hybridoma Sàng lọc, dòng hóa và tăng sinh hybridoma Thu nhận, tinh chế và kiểm tra MAb • Quyết định sự thành công của quy trình • Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành • Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (mAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào) • Được nhận diện bởi mAb mục tiêu • Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh • Có cấu trúc càng giống với kháng nguyên tự nhiên càng tốt. Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật protein tái tổ hợp • Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó. Rabbit Rat Hamster BALB/C Đức, 1967 C57BL/ 6 Mỹ, 1982  Lai cùng dòng  Chuột cái  6-8 tuần tuổi  “sạch tuyệt đối” Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm tĩnh mạch) Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da) Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da) Intramuscular (i.m): into a muscle (tiêm cơ) Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm khoang bụng) Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD Phải đi kèm tá dược (adjuvant)  Với kháng nguyên là protein  Tiêm 10-100 μg/chuột/ lần  Tá dược thường được sử dụng là CFA (Complete Freund’s Adjuvant)  Với kháng nguyên là tế bào  Tiêm 0,5 - 5x107 tb/chuột/lần  Tá dược thường được sử dụng là ALUM (Aluminum hydroxide gel) Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c. 14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c. 28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c. 36 Thu serum 42 Nghỉ trước khi dung hợp (hay tiêm nhắc lần 3) IFA s.c. 52 Tiêm nhắc lần cuối i.v. 55 Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p. 21 Tiêm nhắc lần 1 IFA i.p. 42 Tiêm nhắc lần 2 IFA i.p. 52 Kiểm tra serum 53 ELISA 63 Tiêm nhắc lần 3 IFA i.p. 73 Kiểm tra serum 74 ELISA 84 Tiêm nhắc lần 4 IFA i.p. 94 Kiểm tra serum 95 ELISA 98 Tiêm nhắc lần cuối I,v, 101-110 Thu lách HYBRIDOMA • Được Köhler và Milsten (1975) khám phá khi nuôi cấy liên tục những tế bào tiết kháng thể. • Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy myeloma -oma = tumor (khối u) • Môi trường chọn lọc HAT - hypoxanthine, aminopterin, thymidine • HGPRT - hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase • TK – Thymidine kinase Cell line Ig produced P3-X63Ag8 (Ag8) γ1, κ NS1/1-Ag4.1 (NS1) κ (not secreted) Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) None X63-Ag8.653 (Ag8.653) none Y3-Ag1.2.3 (Y3) - rat κ •Kết dính tự nhiên •Hóa chất (PEG) •Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm) •Virus (sendai) •Vi tiêm • Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường: • Con đường de novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) • Con đường salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine • Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR  tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường salvage • Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage •Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển nhân tạo (Bioreactor, bình roux. •mAb được tiết bào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supernantant cell culture) •Nhược điểm: Nồng độ mAb thu được tương đối thấp (0.01 – 0,5 mg/ml dịch nuôi cấy) •Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor. •Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites) •mAb được tiết vào dịch báng (fluid ascites) •Ưu điểm: Nồng độ Mab thu được khá cao (1-15 mg/ml nước bang) •Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệm • 2,6,10,14 – tetramethylpentadecane •Tách chiêt từ dầu gan cá mập •Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở người. •Gây ra bệnh lao da ở chuột. Là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn •Là yếu tố quan trọng trong kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb •Sắc kí ái lực (affinity chromatography) •Sắc kí trao đổi ion (ion exchange chromatography) •Lọc gel (gel filtration) •Sắc kí cao áp •Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic
Tài liệu liên quan