Sinh học đại cương - Chương III: Enzym

55 Sinh học đại cương Chương III: Enzym 56 Một số khái niệm chung  1700: tiêu hóa thitj nhờ dịch chiết trong dạ dày  1800: chuyển hóa tinh bột thành đường nhừ nước dịch chiết thực vật  1850 - Louis Pasteur: quá trình lên men đường thành rượu của nấm men xảy ra nhờ một nhân tố gọi là men. Men không thể tách ra khỏi cấu trúc tế bào sống  1897- Eduard Buchner: dịch chiết nấm men có khả năng lên men đường thành rượu. Men có thể tách ra khỏi tế bào  1956 – Summer: tách và kết tinh urease. Urease mang bản chất Protein  1930 – John Northrop và Moses Kunitz: tách và tinh chế các enzym tiêu hóa mang bản chất protein - Enzym mang bản chất protein - Tăng tốc độ phản ứng lên 10 mũ 20 lần nhưng không bị tiêu thụ hoặc thay đổi khi xúc tác - Mục đích giúp chuyển hóa thức ăn thành năng lượng và các vật liêụ mới 57 Cấu trúc enzym  Định nghĩa: Enzym là các phân tử protein có chức năng xúc tác sinh học  Enzym đơn cấu tử: thành phần cấu tử chỉ bao gồm các protein đơn giản  Enzym lưỡng cấu tử: bao gồm 2 thành phần  Phần Protein (nhóm nội, apoenzym) - Cấu tạo: từ các axit amin - Tính chất:không bền nhiệt - Chức năng: tăng hiệu lực xúc tác và quyết định tính đặc thù của enzym  Phần nhóm ngoại - Cấu tạo: không mang bản chất protein  Ion vô cơ  Phức hữu cơ (vitamin): là các chất vận chuyển tạm thời các nhóm chức năng đặc hiệu, là một phần trong cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym - Tính chất: kích thước nhỏ, bền nhiệt - Chức năng:trực tiếp tham gia vào phản ứng xúc tác và quyết định kiểu phản ứng. Vitamin Dạng coenzym Nhóm vận chuyển Enzym tương ứng Biotin Biocytin CO2 Propionyl-CoA carboxylase Axit pantothenic và các hợp chất Coenzym A Các nhóm acyl Acetyl-CoA carboxylase Vitamin B12 5'- Deoxyadenosyl cobalamin (coenzym B12) Các nguyên tử H và các nhóm acyl Methylmalonyl- CoA mutase Riboflavin (vitamin B2) Flavin adenin dinucleotit (FAD) Electron, các nguyên tử H Succinate dehydrogenase Axit nicotinic (niacin) Nicotinamide adenin dinucleotit (NAD) Ion H (: H -) Alcohol dehydrogenase Thiamine (vitamin B1) Thiamine pyrophosphate Aldehyt Pyruvate dehydrogenase 58 Danh pháp và phân hạng  Danh pháp - Danh pháp thông thường: cơ chất + ase - Danh pháp quốc tế: cơ chất + kiểu phản ứng + ase - Kí hiệu: EC1234 1: Chỉ enzym thuộc nhóm lớn nào 2: Chỉ enzym thuộc nhóm phụ nào 3: Chỉ enzym thuộc phân nhóm phụ nào 4: Chỉ số thứ tự  Phân hạng: 6 nhóm phản ứng - Oxidoredutase (xúc tác các phản ứng oxi hóa khử) VD: Alcohol dehydrogenase: chuyển hóa rượu thành aldehyt hoặc keton - Transferase (xúc tác các phản ứng vận chuyển các nhóm chức năng) VD: Aminnotransferase: phân hủy axit amin bằng cách loại bỏ nhóm amin - Hydrolase (xúc tác các phản ứng thủy phân) VD: Glucose-6-phosphatase: loại nhóm phosphate khỏi glucose-6-phosphate, tạo glucose và H3PO4 - Lyase (xúc tác các phản ứng tạo liên kết đôi) VD: Pyruvate decarboxylase: loại bỏ CO2 khỏi pyruvate - Isomerase (xúc tác các phản ứng đồng phân hóa học) VD: Ribulose phosphate epimerase: chuyển hóa giữa ribulose 5-phosphate và xylose-5-phosphate - Ligase (xúc tác hình thành các liên kết hóa học nhờ phân cắt ATP) VD: Hexokinase: chuyển hóa giữa glucose và ATP với glucose-6-phosphate và ADP 59 Cấu tạo trung tâm hoạt động  Khái niệm: trong quá trình xúc tác chỉ một phần nhỏ phân tử enzym tham gia kết hợp với cơ chất và chuyển hóa thành sản phẩm – trung tâm hoạt động của enzym  Cấu tạo: bao gồm 1 số nhóm chức năng của axit amin không tham gia liên kết trục chính - COOH: axit glutamic và axit aspatic - NH2 : lysin - OH: Serin - SH: Cystein - Imidazol: Histidin - Phenol: Tyrozin  Tính chất: chỉ được hình thành trong cấu trúc bậc 2,3,4 60 Một số quan niệm về trung tâm hoạt động của enzym  Quan niệm của Fisher (1894) - Trung tâm họat động vốn sẵn có và cứng nhắc Enzym: ổ khóa Cơ chất: chìa khóa  Quan niệm của Kosland (1958) - Trung tâm hoạt động của enzym được hình thành trong quá trình kết hợp với cơ chất và đây là một cấu trúc mềm dẻo, linh động - Cơ chất quyết định cuối cùng đến hình dáng của enzym Enzym: găng tay Cơ chất: bàn tay 61 Trung tâm dị lập thể (Allosteric)  Khái niệm:Trung tâm dị lập thể là vị trí thứ 2 trên phân tử enzym mà các cơ chất (chất allosteric) khi kết hợp vào vị trí này không chuyển hoá tạo thành sản phẩm mà chỉ làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzym cũng như cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym.  Tính chất: thay đổi cấu trúc của enzym theo 2 chiều hướng - Tăng khả năng hoạt động của enzym: điều hòa dương - Giảm khả năng hoạt động của enzym: điều hòa âm 62 Mô hình phản ứng sinh học E: enzym S: cơ chất P: sản phẩm ES: phức hợp enzym-cơ chất EP: phức hợp enzym-sản phẩm 63 Chất phản ứng Sản phẩm N ă n g l ư ợ n g Phản ứng tỏa nhiệt Năng lượng hoạt hóa, Ea Trạng thái chuyển tiếp Bẻ gãy liên kết Hình thành liên kết Tiến trình phản ứng 64 Cơ chế tác dụng của enzym  Cơ chế tác dụng: Enzym làm tăng các phản ứng hóa học trong tế bào nhờ quá trình làm giảm rào cản năng lượng họat hóa - Năng lượng hoạt hóa là rào cản năng lượng phải vượt qua trước khi 1 phản ứng hóa học bắt đầu - Các chất phản ứng phảo hấp thụ Ea để trở nên họat động -làm yếu các liên kết đến mức bẻ gãy được chúng và hình thành liên kết mới. Phản ứng bắt đầu xảy ra. - Enzym làm tăng vận tốc phản ứng mà không làm thay đổi chính bản thân chúng 65 66 Tính chất của enzym  Tính chất chung - Khối lượng phân tử lớn - Hòa tan trong môi trường nước hoặc muối loãng hoặc các dung môi hữu cơ tạo dung dịch keo - Không bền trong môi trường axit và kiềm mạnh  Cường lực xúc tác:Cường lực xúc tác lớn: tăng vận tốc phản ứng lên hàng vạn cho đến hàng triệu lần so với chất xúc tác hóa học 67 Tính chất của enzym (cont.)  Đặc hiệu phản ứng: Enzym có khả năng chuyển hoá một số cơ chất nhất định, một liên kết hoá học nhất định hoặc một kiểu phản ứng hoá học nhất định - Đặc hiệu cơ chất  Đặc hiệu tương đối  Đặc hiệu nhóm  Đặc hiệu tuyệt đối  Đặc hiệu quang học - Đặc hiệu kiểu phản ứng  Enzym không độc  Enzym ứng dụng trong điều kiện nhẹ nhàng  Enzym được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền 68 Các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính của enzym  Nồng độ cơ chất Et: Nồng độ enzym tổng E: Nồng độ enzym tự do (E=Et-ES) ES: Nồng độ enzym trong phức hợp với cơ chất k1: hằng số vận tốc tạo phức trung gian ES k-1: hằng số vận tốc phân ly trung gian tạo E và S k2: hằng số vận tốc phân ly phức ES tạo sản phẩm và enzym tự do V0: vận tốc ban đầu Vmax: vận tốc cực đại Km: hằng số Michaelis Công thức Michaelis-Menten maxmax0 1 ][ 1 . 1 VSV K V m  69 Các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính của enzym (cont.)  Ý nghĩa của giá trị Km: Km rất khác nhau giữa các enzym, thậm chí là giữa cùng 1 enzym với các cơ chất khác nhau cũng sẽ cho các Km khác nhau. Km được xem như là một chỉ thị đặc trưng cho ái lực của enzym với cơ chất của nó. Km càng nhỏ thì ái lực giữa enzym và cơ chất càng lớn và ngược lại. 70 Các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính của enzym (cont.)  Chất kìm hãm - Khái niệm: là chất làm họat động enzym yếu đi hoặc chấm dứt hoàn toàn. - Phân loại:  Chất kìm hãm thuận nghịch - Chất kìm hãm cạnh tranh - Chất kìm hãm không cạnh tranh  Chất kìm hãm bất thuận nghịch - Chất kìm hãm bất thuận nghịch do sản phẩm của phản ứng - Chất kìm hãm bất thuận nghịch do thừa cơ chất 71 Kìm hãm cạnh tranh  Khái niệm: tham gia cạnh tranh với cơ chất để kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym. Khi mà chất cạnh tranh (I) kết hợp được vào với trung tâm hoạt động, nó sẽ ngăn cản quá trình kết hợp của cơ chất với enzym.  Đặc tính: - Các chất kìm hãm cạnh tranh là các hợp chất có cấu tạo giống với cơ chất. Nó sẽ kết hợp với enzym tạo phức EI nhưng không dẫn đến quá trình xúc tác để chuyển hoá thành sản phẩm. Thậm chí sự kết hợp rất nhanh chóng của dạng phức này cũng dẫn đến làm giảm khả năng hoạt động của enzym. - Khi [S] lớn hơn rất nhiều lần so với [I], quá trình kết hợp với enzym của các chất kìm hãm sẽ ở mức tối thiểu.  Công thức Michaelis Menten ][ ][max 0 SK SV V m    maxmax1 1 ][ 1 )( 1 VSV K V m i   72 Kìm hãm không cạnh tranh  Khái niệm:Cơ chất và chất kìm hãm kết hợp với enzym tại 2 vị trí khác nhau. Chất kìm hãm không cạnh tranh làm thay đổi cấu trúc, hình dạng của enzym cũng như trung tâm hoạt động của enzym, từ đó làm giảm vận tốc của phản ứng.  Đặc tính: cấu tạo của cơ chất và chất kìm hãm không giống nhau.  Công thức Michaelis Menten max ' max ' 2 ][ 1 )( 1 VSV K V m i   ' ' ][1 IK I  ][ ]][[' EIS IES K I  ][ ][ '' max 0 SK SV V m    73 Kìm hãm bất thuận nghịch  Đặc tính: Các chất kìm hãm không thuận nghịch là các chất thường tạo liên kết đồng hoá trị với enzym hoặc phá huỷ các nhóm chức năng cần thiết cho hoạt tính của enzym hoặc tạo ra các quá trình kết hợp không đồng hoá trị bền.  Phân loại: - Sản phẩm phản ứng: nồng độ sản phẩm tạo thành quá lớn, sản phẩm sẽ có khả năng kết hợp lên vị trí thứ 2 bất kỳ của enzym ngoài trung tâm hoạt động làm biến dạng enzym và làm giảm vận tốc phản ứng. Sản phẩm đóng vai trò là các chất kìm hãm không cạnh tranh. - Cơ chất phản ứng: nồng độ cơ chất quá lớn có khả năng kết hợp với một vị trí thứ 2 của enzym cũng như vào trung tâm hoạt động của enzym làm thay đổi hình dáng của enzym và từ đó làm giảm vận tốc phản ứng. 74 Các yếu tố ảnh hướng đến hoạt tính của enzym (cont.)  Nhiệt độ - Nhiệt độ tối ưu: là nhiệt độ tại đó vận tốc phản ứng đạt tốc độ lớn nhât. - Nhiệt độ tối ưu của mỗi enzym phụ thuộc môi trường mà nó tồn tại.  pH - pH tối ưu: là pH tại đó vận tốc phản ứng đạt tốc độ lớn nhất - Nguyên tắc: duy trì trạng thái ion hóa của các nhóm chức năng tại trung tâm họat động và trong toàn cấu trúc protein - Khoảng họat động: axit yếu, bazơ yếu hoặc trung tính  Chất họat hóa - Khái niệm: là các chất làm enzym từ trạng thái hoạt động yếu trở nên mạnh hoặc từ không họat động trở nên hoạt động - Bản chất hóa học: + Coenzym vận chuyển điện tử, hydro + Chất phá vỡ liên kết peptit bảo phủ trung tâm hoạt động của enzym +Chất phục hồi các nhóm chức năng của enzym + Ion kim loại  Nồng độ enzym - Vận tốc phản ứng phụ thuộc trong trường hợp thừa cơ chất 75 Enzym cố định  Định nghĩa: Enzym cố định là enzym được cố định về mặt vật lý học cùng với việc giữ được các hoạt tính xúc tính xúc tác của chúng để sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần.  Nhược điểm của enzym tan - Enzym mang bản chất protein nên tan trong nước, dẫn đến việc khó phân tách chúng sau phản ứng để thu hồi. - Một số sản phẩm tạo ra có thể trở nên ức chế các enzym tan.  Ưu điểm của enzym cố định - Dễ dàng thu hồi enzym sau phản ứng - Độ bền tăng đáng kể: bền nhiệt, vận tốc phản ứng tăng - Kiểm soát quá trình xúc tác chính xác hơn - Tái sử dụng nên giá thành sản phẩm giảm - Thời gian sử dụng dài - Phân tách sản phẩm nhanh chóng sẽ giảm quá trình ức chế ngược 76 Phương pháp cố định enzym Phương pháp cố định Bao gói Liên kết Hấp phụ Liên kết đồng hóa trị Bao gói mạng lưới Vi bao gói 77 Phương pháp cố định enzym  Phương pháp bao gói: enzym được trộn lẫn với tiền chất của gel hoặc các monomer. Gel hình thành hoặc quá trình polyme hóa các monomer sẽ bao gói các gel lại.  Ưu điểm - Enzym không có những thay đổi về mặt hóa học - Đặc tính enzym không thay đổi  Nhược điểm - Quá trình bất hoạt enzym xảy ra trong quá trình hình thành gel - Rõ rỉ enzym xảy ra liên tục phụ thuộc vào kích thước lỗ gel - Quá trình giới hạn khuếch tán làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzym và cơ chất  VD- Gel: alginate, agar, agarose, collagen - Monomer: acrylamide 78 Phương pháp cố định enzym (cont.)  Phương pháp vi bao gói: enzym được bao gói trong màng bán thấm dưới dạng giọt hình cầu rỗng vi mô.  Ưu điểm - Không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym - Mỗi enzym liên kết gần nhất với cơ chất trong môi trường lỏng xung quanh  Nhược điểm - Giới hạn khả năng khuyếch tán sẽ giới hạn khả năng chuyển động của cơ chất tới trung tâm hoạt động của enzym - Không thích hợp cho các enzym proteolytic hoặc các phân tử cơ chất lớn. 79 Phương pháp cố định enzym (cont.)  Phương pháp liên kết đồng hóa trị: enzym được hấp phụ lên bề mặt chất mang nhờ quá trình hình thành các liên kết đồng hóa trị thông qua các nhóm chức năng.  Các nhóm chức năng phổ biến nhất của chất mang - Nhóm amin - Nhóm cacboxyl - Nhóm hydroxyl - Nhóm sulphydryl  Chất mang: polyme từ acrylamide, maleic anhydride, polyme từ styrene, polypeptit  Nhược điểm: các nhóm chức năng không nằm tại trung tâm hoạt động của enzym do đó cần có các hợp chất hóa học để họat hóa các nhóm chức năng này. 80 Phương pháp cố định enzym (cont.)  Phương pháp hấp phụ: là phương pháp đơn giản nhất. Enzym hấp phụ vật lý lên trên bề mặt của chất mang nhờ các liên kết yếu như Van der Waals.  Chất mang: alumina, clay, silica, nhựa trao đổi ion, CaCO3, nhựa trao đổi cation, collagen và thủy tinh.  Ưu điểm - Quá trình cố định đơn giản và dễ dàng thực hiện - Quá trình hấp phụ thuận nghịch - Enzym không bi vô họat trong quá trình hấp phụ  Nhược điểm - Quá trình hấp phụ không đặc hiệu: ngoài enzym có các cơ chất khác cũng có thể hấp phụ lên chất mang. - Thời gian phủ mẫu dài và lực liên kết yếu 81 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzym  Tính chất của enzym tự do  Dạng chất mang được sử dụng  Phương pháp họat hóa chất mang  Phương pháp cố định enzym 82 Tính chất của enyzm cố định  Nguồn thu enzym  Dạng tồn tại vật lý của enzym  Độ tinh sạch của enzym (phương pháp tinh sạch)  Họat tính xúc tác: quyết định độ nhạy của enzym cố định 83 Dạng chất mang  Tính chất  Không tan trong nước - Có khả năng liên kết với enzym cao - Trơ về mặt hóa học - Có cơ chế họat động ổn định và bền  Điện tích bề mặt và tính kị nước  Diện tích bề mặt: diện tích lỗ, kích thước hạt, đường kính ống  Đặc điểm chuyển khối  Quá trình khuếch tán tại chỗ của hệ thống  Phân loại - Polyme kị nước dựa trên các polysaccarit tự nhiên như agarose, dextran và cellulose. - Polyme hydrocacbon tổng hợp ưa béo như polyacrylamide, polystyrene và nylon. - Các vật liệu vô cơ như oxit sắt, hạt thủy tinh 84 Phương pháp họat hóa chất mang  Polysacarit - Derivatization các nhóm hydroxy chức năng - Tác nhân: cyanogen bromide, các dẫn xuất triazin, ganuric chloride, sodium periodate, expoxide hoặc benzoquinone  Poacrylamide và dẫn xuất: hoạt hóa nhờ phản ứng diamine  Chất mang vô cơ: họat hóa nhờ phản ứng với glutaraldehyt 85 Đặc tính của enzym cố định  Dạng tồn tại: hạt, màng, ống, sợi  Hoạt tính enzym còn lại sau khi cố định  % enzym được cố định lên chất mang