Thực hành Hóa sinh

Bài 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG (ĐẠM TỔNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP MICRO – KJENDAHL I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM: Phương pháp Micro – Kjendahl thường được dùng để xác định lượng đạm tổng trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật. II. NGUYÊN TẮC: Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị ôxy hóa. Cacbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn Nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0,1N; định phân lượng H2SO4 0,1N còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua đó dễ dàng tính được lượng Nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm. III. DỤNG CỤ HÓA CHẤT: 1. Dụng cụ: - Máy cất đạm - Tủ Hotte - Ống Kjendahl 50ml - Ống đong 25ml - Pipette 2ml; 10ml - Erlen 500ml - Bình định mức 100ml - Burette 25ml - Becher 100ml; 250ml. 2. Hóa chất: - H2SO4 đậm đặc; - H2SO4 0,1N - CuSO4 tinh thể - K2SO4 tinh thể - NaOH 0,1 N; 40% - Phenolphtalein. IV. CÁCH THỰC HIỆN: 1.Vô cơ hóa mẫu (thực hiện khi có mặt của giáo viên hướng dẫn) - Tiến hành trong tủ Hotte. - Hút 2ml nước mắm cho vào ống Kjendahl. Thêm vào từ từ 10ml H2SO4 đậm đặc tỉ trọng 1,84. Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm chất xúc tác. Tốt nhất là dùng 0,5g hỗn hợp K2SO4; CuSO4; Se (100:10:1). Có thể dùng Se kim loại (0,05g) hoặc dùng 5g hỗn hợp CuSO4:K2SO4 (1:3). Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi làm tăng vận tốc quá trình phản ứng. Có thể dùng xúc tác là acid perchloric HClO4 giải phóng O2 cho phản ứng Oxy hóa. Sau khi thêm các chất xúc tác, đặt các ống Kjendahl vào thiết bị vô cơ hoá mẫu. Cài đặt chế độ theo hướng dẫn. Quá trình đốt đạm kết thúc khi dung dịch trong ống chuyển sang màu xanh trong. Làm nguội dung dịch, định mức đến 100ml bằng bình định mức. Sau đóm tiến hành cất đạm 2. Cất đạm: Tiến hành cất đạm trong máy cất đạm theo các bước sau: Bước 1: Cắm điện Bước 2: Nhấn công tắc để mở máy Bước 3: Chờ 3 phút trước khi cất mẫu Bước 4: Lắp bình Kjendahl và bình hứng mẫu (Erlen) vào đúng vị trí, chú ý: - Không lắp lệch, khí sẽ thoát ra ngoài gây mất mẫu - Nhúng ngập ống vào dung dịch lỏng Bước 5: Nhấn và giữ nút NaOH 40% để lấy lượng xút cần thiết (khoảng 10ml). Bước 6: Chờ 10 giây để phản ứng xảy ra Bước 7: Nhấn nút Steam để chưng cất trong 8’ Bước 8: Ngưng chưng cất bằng nút Steam Bước 9: Lấy Erlen ra khỏi máy, nhớ tráng nước cất để lấy hết mẫu bám bên trong và bên ngoài ống. Bước 10: Lấy bình Kjendahl ra khỏi máy bằng găng tay dầy hoặc bằng kẹp 3. Định phân: - Lấy erlen ra khỏi máy, nhớ tráng nước cất để lấy hết mẫu bám bên trong ống. - Cho 10 giọt phenolphtalein vào bình và định phân bằng NaOH 0,1N. 4. Định T: - Lấy 10ml H2SO4 0,1N vào erlen định phân bằng NaOH 0,1N. - Tính nồng độ thực tế của NaOH đem định phân. - T là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tính toán của NaOH. V. TÍNH KẾT QUẢ: Hàm lượng Nitơ tòan phần trong nước mắm được tính theo công thức sau: x = Trong đó: x: hàm lượng Nitơ tính bằng g/100g. a: số ml H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3. b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ. P: trọng lượng mẫu vật đem vô cơ hóa (g) 0,0014 lượng gam Nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N. T: Hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1N. VI. BÀN LUẬN. Bài 2: CHUẨN ĐỘ FORMOL THEO PHƯƠNG PHÁP CHỈ THỊ I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM: Xác định được hàm lượng nhỏ đạm formol với độ chính xác cao với các mẫu nước chấm, nước mắm, chao, tương... cho kết quả thỏa mãn. Phương pháp dùng hỗn hợp chỉ thị phenolphtalein và bromthymol xanh. Ranh giới chuyển màu trước và sau điểm tương đương rất rõ ràng nên kết quả ổn định. Thời gian phân tích nhanh, điều kiện tiến hành đơn giản và ít tốn hóa chất. II. DỤNG CỤ – HÓA CHẤT: 1. Dụng cụ: - Bình định mức 100ml. - Pipette 1ml; 10ml - Ống đong 10ml - Erlen 100ml - Becher 100ml - Burette 25ml 2. Hóa chất: - HCl 0,05N - NaOH 0,05N; 0,1 N - Phenolphtalein 0,5% - Bromthymol blue 0,4% - Dung dịch formol trung tính IV. CÁCH THỰC HIỆN: * Pha formol trung tính: - Dùng pipette hút 10ml formol cho vào erlen sau đó hút thêm 10ml nước cất cho vào lắc đều rồi nhỏ tiếp vào đó 3 giọt phenoltalein, sau đó em chuần độ bằng dung dịch NaOH 0.1N. - Dùng pipette hút 5ml nước mắm cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch lắc kỹ. - Dùng pipette hút lấy 10ml nước mắm từ bình định mức cho vào erlen dung tích 100ml. Thêm vào đó 15 giọt bromthymol blue dung dịch 0,04%. Lúc này nếu dung dịch có màu vàng thì nhỏ vào từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu xanh. Sau đó cho tiếp vào 5 giọt phenolphtalein dung dịch rượu 0,5% và 5ml dung dịch formol trung tính. Chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi màu dung dịch chuyển từ vàng sang tím. V. CÁCH TÍNH KẾT QUẢ: Hàm lượng Nitơ formol tính thành số gam Nitơ có trong 1 lít nước mắm theo công thức: x = (g/l) Trong đó: x: hàm lượng Nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm, g/l a: thể tích NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ, ml 0,0007: lượng Nitơ ứng với 1ml NaOH 0,05N, g V0: dung tích bình định mức, ml V1: thể tích dung dịch lấy để chuẩn độ, ml V: thể tích nước mắm lấy để định mức VI. BÀN LUẬN: Bài 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ẨM, HÀM LƯỢNG MUỐI ĂN, ĐỘ ACID ššš&››› I. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ẨM: 1. Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong thực phẩm. Cân trọng lượng thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính phần trăm nước có trong thực phẩm. 2. Dụng cụ: - Cốc sấy có nắp - Bình hút ẩm - Tủ sấy nhiệt độ 100 ¸1050C - Cân phân tích, độ chính xác 0.0001 g. 3. Tiến hành: + Xác định khối lượng cốc khô tuyệt đối: Sấy cốc ở nhiệt độ 1050C trong 3 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân và xác định được khối lượng cốc khô (tính luôn nắp). + Xác định khối lượng khô tuyệt đối của mẫu: Cân khoảng 3 - 5g mẫu thử đã nghiền nhỏ cho vào cốc có nắp đã sấy đến trọng lượng không đổi. Đặt cốc vào tủ sấy ở nhiệt độ 60¸800C trong 30 phút. Sau đó nâng dần nhiệt độ đến 1050C và sấy trong 3 giờ. Đậy nắp lại, lấy mẫu ra, để nguội trong bình hút ẩm, đem cân. Tiếp tục sấy thêm 30 phút ở nhiệt độ 1050C, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân. Cứ lặp lại như trên cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp sau cùng không được cách nhau quá 0,5mg (mẫu đã khô). 4. Tính kết quả: x = Trong đó: x: hàm lượng ẩm của mẫu (%) a: khối lượng mẫu trước khi sấy (g) b: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g) Sai lệch giữa hai lần xác định song song không được lớn hơn 0,5%. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của hai lần xác định song song. II. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MUỐI ĂN: 1. Dụng cụ và hoá chất: - Pipette 10ml - Becher 100ml - Kali cromat 10% - AgNO3 0,1N 2. Tiến hành: Dùng pipette hút 5ml nước mắm cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch lắc kỹ. Dùng pipette hút 10ml nước mắm từ bình định mức trên cho vào erlen. Thêm vào 40ml nước cất, 1ml Kali cromat 10%. Chuẩn độ bằng AgNO3 0,1N đến khi có màu đỏ gạch. 3. Tính kết quả: x = Trong đó: x: hàm lượng muối ăn có trong nước mắm, g/l a: thể tích AgNO3 0,1N dùng để chuẩn độ, ml 0,00585: lượng muối ăn ứng với 1ml AgNO3 0,1N, g V0: dung tích bình định mức, ml V1: thể tích dung dịch lấy để chuẩn độ, ml V: thể tích nước mắm lấy để định mức, ml III. XÁC ĐỊNH ĐỘ ACID: 1. Dụng cụ và hoá chất: - Pipette 1ml - Becher 100ml - Phenolphtalein 0,5% - NaOH 0,1N 2. Tiến hành: Dùng pipette hút 1ml nước mắm (đã chuẩn bị ở phần II) cho vào cốc thủy tinh. Thêm vào 50ml nước cất trung tính, 5 giọt phenolphtalein dung dịch rượu 0,5%. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi hiện màu hồng, bền trong 10 giây. 3. Tính kết quả: Tính hàm lượng acid theo acetic, g/l x = Trong đó: x: hàm lượng axit có trong nước mắm, g/l a: thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ, ml V0: dung tích bình định mức, ml V1: thể tích dung dịch lấy để chuẩn độ, ml V: thể tích nước mắm lấy để định mức, ml 1ml NaOH 0,1N ứng với 0,006g acid acetic. Bài 4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LIPID TRONG NGUYÊN LIỆU I. NGUYÊN TẮC Nguyên liệu đã được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên liệu bằng ether ethylic hoặc ether dầu hỏa trên máy Soxhlet, xác định khối lượng chất béo được trích ly ra bằng 2 cách: tính lượng mẫu bị mất đi sau khi trích ly chất béo; hoặc đuổi dung môi thu được trực tiếp lượng chất béo được trích ly ra khỏi mẫu, cân khối lượng. II. DỤNG CỤ – HÓA CHẤT 1. Dụng cụ Bộ Soxhlet Tủ sấy 1050C Giấy gói mẫu Cân Cối chày sứ Bình hút ẩm Ống đong Cốc đốt 100ml Kẹp inox 2. Hóa chất Các mẫu nguyên liệu trích ly Na2SO4 Ether ethylic hoặc ether dầu hỏa Dung môi ether phải không chứa peroxyt, nước, rượu và có độ sôi khoảng 40 ÷500C. Dung môi này được xử lý như sau: + Ether 500ml + Dung dịch NaOH hoặc KOH 40% 5ml + Dung dịch KMnO4 4% 50ml Để trong 24h, thỉnh thoảng lắc đều, sau đó rửa 4 – 5 lần bằng nước cất, loại bỏ nước bằng bình lóng, cho thêm 50g Na2SO4 khan và để trong 24h, chưng cất ether, bảo quản trong chai thủy tinh màu. III. TIẾN HÀNH 1. Chuẩn bị dụng cụ: Rửa sạch, tráng lại ống trụ Soxhlet, bình cầu bằng aceton. Sấy dụng cụ trong tủ sấy ở 100 ÷1050C 2. Chuẩn bị túi bột trích ly Chuẩn bị một tờ giấy lọc hay giấy xốp có kích thước 10x15cm. Cuộn lại thành ống hình trụ có đường kính khoảng 2,5 cm (tùy theo đường kính của bầu chiết). Gấp kín một đầu làm đáy, lót vào một ít bông gòn cho kín. Sấy giấy lọc đến trọng lượng không đổi. Lấy khoảng 30 gram hạt nguyên liệu đem nghiền nhỏ. Cân chính xác khoảng 5 gram bột nghiền, làm khô nguyên liệu bằng cách sấy nguyên liệu trong tủ sấy 100 ÷1050C đến khối lượng không đổi. Cũng có thể làm khô bằng cách thêm Na2SO4 khan, một lượng gấp đôi nguyên liệu, trộn đều. Cho mẫu vào ống giấy hình trụ. Lót phía trên một ít bông gòn rồi gấp miệng ống giấy lại cho kín. 3. Tiến hành trích ly Lắp hệ thống hoàn lưu Soxhlet, cho gói mẫu vào ống trụ. Chú ý chiều cao của túi bột phải thấp hơn mức trên của ống xiphông của bầu chiết. Sau đó lắp bình cầu có chứa dung môi (dung môi khoảng ¾ thể tích bình cầu) Cho nước chảy liên tục trong ống sinh hàn Đun nóng ether trong bình bằng thiết bị xác định lipid, chỉnh ở nhiệt độ 40 ÷500C. Trích ly lipid trong 8 ÷10h (3-5h) với điều kiện tốc độ dung môi chảy đầy ống trụ là 10 phút. Nếu cần dừng lại phải để ether đầy ống trụ để các bao mẫu nhúng ngập trong ether Kiểm soát nguyên liệu đã trích ly hết lipid bằng cách sau: + Ether trong ống trụ không màu + Lấy vài giọt dung môi trong ống hình trụ, nhỏ vào một miếng giấy lọc. Nếu vết loang dung môi sau khi khô không phân biệt được trên nền giấy trắng thì coi như đã trích ly hết lipid + Lấy vài giọt dung môi nhỏ trên một kính thủy tinh lõm, khi bay hơi hết dung môi nếu không còn đọng lại vết chất béo, coi như đã trích ly hết lipid Khi ether chảy hết xuống bình, lấy gói mẫu ra khỏi ống chiết. IV. KẾT QUẢ 1. Nếu chỉ trích ly chất béo trong 1 mẫu nguyên liệu: Gắn bình cầu vào một ống hoàn lưu nghiêng để thu hồi ether . Đổ cặn lipid vào một cốc đốt 100ml (đã cân chính xác trọng lượng). Tráng bình cầu vài lần bằng ether (khoảng 10 ml/lần), cho hết vào cốc đốt Đun cách thủy nhẹ để đuổi ether, sau khi ether bay hết, cho vào tủ sấy 100÷1050C trong 1h, để nguội trong bình hút ẩm, cân chính xác Hàm lượng lipid được tính theo công thức: L = Trong đó: L: hàm lượng lipid trong mẫu (%) m1: khối lượng cốc đốt chứa lipid (g) m2: khối lượng cốc đốt không (g) m: khối lượng nguyên liệu (g) 2. Xác định đồng thời hàm lượng lipid thô trong nhiều mẫu Sấy khô 5g mẫu và giấy gói như trên. Khi cho mẫu vào gói giấy, cân chính xác các gói giấy có chứa mẫu. Xếp tất cả các gói giấy vào ống trụ của máy Soxhlet Tiến hành trích ly như đã trình bày ở trên Khi đã trích ly hết lipid, lấy các gói giấy ra và sấy khô ở 100 ÷1050C đến trọng lượng không đổi. Phần dung môi và lipid cũng đem chưng cất thu hồi dung môi ether Lipit trong mẫu được tính bằng công thức  L = Trong đó L: hàm lượng lipid trong mẫu (%) m1: khối lượng gói nguyên liệu chưa trích ly lipid (mẫu + giấy)(g) m2: khối lượng gói nguyên liệu sau khi trích ly lipid (mẫu + giấy)(g) m: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) Bài 5 XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ SỐ CỦA LIPID A. CHỈ SỐ ACID I. NGUYÊN TẮC: Chỉ số acid là số mg KOH cần để trung hòa các acid béo tự do có trong 1g chất béo Trung hòa lượng acid béo tự do có trong chất béo bằng dung dịch KOH, phản ứng xảy ra: RCOOH + KOH ® RCOOR + H2O Dựa vào lượng KOH dùng để trung hòa các acid, tính chỉ số acid II. DỤNG CỤ – HÓA CHẤT: 1. Dụng cụ: Burette 25ml Erlen 100ml nút nhám Becher 100ml Ống đong 25ml 2. Hóa chất: Ether ethylic Rượu ethylic 960 KOH 0,05N trong rượu (960) Phenolphtalein 1% trong rượu Thymolphtalein 1% trong rượu III. TIẾN HÀNH: Lấy vào erlen sạch khô chính xác khoảng 3g chất béo Thêm 30ml hỗn hợp etherethylic – rượu ethylic (1:1) để hòa tan chất béo. Nếu sau khi lắc chất béo chưa tan hết, có thể đun nhẹ trên nồi cách thủy, lắc đều. Định phân hỗn hợp bằng dung dịch KOH 0,05N trong rượu (dùng dung dịch KOH trong rượu để tránh những sai sót có thể xảy ra do sự thủy phân của chất béo trong trường hợp khi hỗn hợp chứa quá nhiều nước từ 20% trở lên) với chỉ thị phenolphtalein (5 giọt) cho đến khi xuất hiện màu hồng tươi. Trường hợp chất béo có màu thẫm thì dùng chỉ thị thymolphlein (1ml) định phân cho đến màu xanh. IV. KẾT QUẢ Chỉ số acid tính theo công thức: Trong đó: V: thể tích dung dịch KOH dùng định phân (ml) T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch KOH m: lượng mẫu thí nghiệm (g) 2,8055: số mg KOH có trong 1ml KOH 0,05N B. CHỈ SỐ XÀ PHÒNG: I. NGUYÊN TẮC: Cho nguyên liệu (lipid) kết hợp với một lượng thừa KOH để xà phòng hóa chất béo. Định phân phần KOH còn lại giúp ta suy ra chỉ số xà phòng hóa. II. DỤNG CỤ – HÓA CHẤT: 1. Dụng cụ Burette 25ml Ống đong 25ml Bếp cách thủy 2 bình cầu 100 ml và 2 ống làm lạnh 2. Hóa chất: Các mẫu lipid khảo sát Rượu ethylic 960 Dung dịch KOH 0,5 N trong rượu (cồn 960) Phenolphtalein 1% trong rượu Dung dịch HCl 0,5 N trong rượu III. TIẾN HÀNH: Lấy 1g chất béo cho vào bình cầu Thêm vào 20ml KOH 0,5N Lắp ống sinh hàn Đun sôi hoàn lưu từ 45 đến 60 phút. Sự xà phòng hóa kết thúc khi dung dịch ở trong bình trong suốt. Làm nguội hỗn hợp. Thêm vài giọt phenolphtalein vào bình. Chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,5 N. Làm thí nghiệm kiểm tra song song bằng cách thay chất béo bằng nước cất IV. TÍNH KẾT QUẢ: Chỉ số xà phòng tính theo công thức: Trong đó: a: thể tích dung dịch HCl 0.5N dùng định phân bình kiểm tra (ml) b: thể tích dung dịch HCl 0.5N dùng định phân bình bình thí nghiệm (ml) - m: lượng mẫu thí nghiệm (g) 28,055: số mg KOH có trong 1ml KOH 0,5N Bài 6 XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ SỐ CỦA LIPID (tiếp theo) C. CHỈ SỐ PEROXYT: I. NGUYÊN TẮC: Chỉ số peroxyt là số gam Iod được giải phóng ra khi cho dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác dụng của peroxyt có trong chất béo Xác định chỉ số peroxyt dựa trên nguyên tắc : các peroxyt của chất béo (tạo thành trong quá trình ôi hóa chất béo) trong môi trường acid có khả năng phản ứng với KI thải ra Iod theo phản ứng: R1 - CH-CH R2 + 2KI + 2CH3COOH ® R1- CH- CH-R2 + 2CH3COOK O –O O + H2O + I2 Iod tạo thành được định phân bằng dung dịch Thiosulfat natri Na2S2O3 + I2 ® 2NaI + Na2S4O6 II. DỤNG CỤ – HÓA CHẤT 1. Dụng cụ: Erlen nút nhám Ống đong 25ml Pipette 1ml Burette 25 ml 2. Hóa chất: Cloroform – Acid acetic băng (tỷ lệ 1: 2) Dung dịch KI bão hòa Na2S2O3 0,01N Chỉ thị hồ tinh bột 1% III. CÁCH TIẾN HÀNH: Lấy vào erlen 100ml chính xác 3 ÷5 g chất béo Thêm vào 15 ÷30ml hỗn hợp Cloroform – Acid acetic băng (tỷ lệ 1: 2) Thêm 1ml dungdịch KI bão hòa Lắc đều hỗn hợp trong 1 phút, để yên trong 3 phút trong bóng tối Thêm vào hỗn hợp 25 ml nước cất và định phân Iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột (dùng 5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%) Tiến hành thí nghiệm kiểm chứng thay chất béo bằng nước cất IV. TÍNH KẾT QUẢ: Chỉ số peroxyt (P) tính theo công thức: Trong đó: a : số ml Na2S2O3 0,01N dùng định phân mẫu kiểm chứng b: Số ml Na2S2O3 0,01N dùng định phân mẫu thí nghiệm T: Hệ số hiệu chỉnh nồng độ của thiosulfat m: khối lượng mẫu thí nghiệm (g) 0,001269 : lượng gram Iod ứng với 1ml Na2S2O3 0,01N D. CHỈ SỐ IOD: I. NGUYÊN TẮC: Chỉ số Iod là số gram Iod kết hợp với 100g chất béo Một số nối đôi trong acid béo của lipid cho phản ứng cộng với 3 nguyên tử nhóm Halogen (trên nguyên tắc). Nếu ta cho chất béo tác dụng với một lượng thừa Halogen và xác định lượng thừa ấy, ta sẽ suy ra được chỉ số Iod II. DỤNG CỤ – HÓA CHẤT: 1. Dụng cụ: Erlen nút nhám Ống đong 25ml Pipette 1ml Burette 25 ml 2. Hóa chất: Cloroform khan Dung dịch KI 10% Dung dịch Na2S2O3 0,1N Chỉ thị hồ tinh bột 0.5% Thuốc thử Hanus: 10g IBr hòa tan trong 500ml acid acetic đặc III. TIẾN HÀNH: Cân chính xác khoảng 0,2 chất béo vào erlen 100ml nút nhám Thêm 10ml cloroform khan, lắc tròn để hòa tan chất béo Thêm 10 ml thuốc thử Hanus, lắc đều, đậy nắp erlen lại, để vào chỗ tối trong 30 phút Thêm tiếp 15 ml dung dịch KI 15%, lắc đều Thêm 25 ml nước cất lắc kỹ. Định phân lượng Iod bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N thành màu vàng nhạt, thêm vài giọt hồ tinh bột, dung dịch có màu xanh, định phân tiếp đến khi mất màu. Nhớ lắc kỹ để tách Iod đang còn nằm trong clorofrom Tiến hành song song mẫu trắng, thay chất béo bằng nước cất (0,2ml) IV. TÍNH KẾT QUẢ: Chỉ số Iod (I) tính theo công thức: Trong đó: a : số ml Na2S2O3 0,1N dùng định phân mẫu kiểm chứng b: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm T: Hệ số hiệu chỉnh nồng độ của thiosulfat m: khối lượng mẫu thí nghiệm (g) 0,0127 : lượng gram Iod ứng với 1ml Na2S2O3 0,1N Bài 7 XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ – ĐƯỜNG TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP FERRY CYANURE I. NGUYÊN TẮC: Với một lượng nhất định ferrycyanure K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, có mặt dung dịch NaOH, sản phẩm thu được là ferrocyanure. Dựa vào lượng ferrycyanure đã dùng, có thể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được xác định trong môi trường kiềm, khi đun nóng với chỉ thị methylen blue. Phương trình phản ứng: CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH ® CH2OH-(CHOH)4-COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dùng dung dịch kiềm của sulfat đồng do không tạo tủa và phản ứng kết thúc rõ ràng. Cần chú ý rằng, phản ứng oxy hóa đường khử bằng tạo dung dịch ferrycyanure không thể tính toán bằng lý thuyết, mà dựa vào công thức thực nghiệm để suy ra nồng độ đường tổng. Kết quả chính xác phụ thuộc nhiều yếu tố, nhưng trình tự và độ chính xác khi thao tác là quan trọng nhất. II. DỤNG CỤ- HÓA CHẤT: Dụng cụ: Bếp điện, kẹp, lưới amiăng Nồi cách thủy Phễu lọc Bình định mức 100ml Becher 100ml Burette 25ml Pipette 5ml, 10ml, 50ml Ống đong 10ml Hóa chất K3Fe(CN)6 Đường glucose 0,5% NaOH 5%, 2,5N HCl 5% (CH3COO)2Pb 10% Na2HPO4 Phenolphtalein Methylen blue III. CÁCH TIẾN HÀNH Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: Tùy đối tượng nghiên cứu: hạt, rau, quả, … cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau: * Nguyên liệu không chứa nhiều tinh bột hoặc inulin: Có thể chiết đường từ mẫu nguyên liệu bằng nước: Cân và cho vào cối sứ 1÷2g mẫu nguyên liệu đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến trọng lượng không đổi) nếu là hạt hoặc các mẫu thực vật như cây, lá hoặc quả khô; 5÷10g nếu là nguyên liệu tươi như hoa quả tươi. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70÷800C. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 100ml, đun cách thủy ở 75÷800C trong 35÷40 phút. Kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch acetat chì 10% hay triclacetic 5%. Nếu dùng acetat chì thì tránh dùng quá dư (2÷5ml), sau đó loại bỏ lượng acetat chì bằng dung dịch bão hòa Na2HPO4 (3÷5ml) thêm với lượng vừa đủ để kết tủa hoàn toàn acetat chì dư. Để yên hỗn hợp trong 10 phút, thêm nước cất tới vạch định mức100ml, lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nước lọc dùng làm thí nghiệm xác định đường khử. Để xác định đường tổng: + Lấy vào bình định mức 100ml chính xác 50ml dung dịch xác định đường khử. Thêm 20ml dung dịch HCl 5%,